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细胞信号转导4章
第四章G蛋白与胯膜细胞信号转导
G蛋白(GTPbindingproteins)一词,一般是指与膜受体偶联的异三聚体G蛋白(heterotrimericGTPbindingprotein)。
然而,最近几年来在该领域的研究成果表明除了与膜受体偶联的G蛋白以外。
还发现许多其它类型的GTP结合蛋白,它存在于不同的细胞部位,而且在细胞信号传递中扮演着重要角色。
其中,一大类称为“小G蛋白”(smallGTP—bindingproteins),因其分子量较小(20一30kD)而得名,其特点是它们都是单体(monomeric)。
其中,大家最熟悉的就是Ras,它是在这类G蛋白中第一个被发现的。
从更广泛的角度来看,所有能与GTP结合的蛋白质都可以称为“G蛋白”,但它们可能与细胞信号传递并无直接的联系,如在蛋白质合成中的伸长因子(elongationfactor)也是一种GTP结合蛋白。
因所有的GTP结合蛋白都具有水解GTP生成GDP的能力,即具有GTP酶(GTPase)的活性。
所以把所有这些GTP结合蛋白都归属于“G蛋白超家族”(GTP-bindingproteinsuperfamily)。
Rodbell等在80年代初注意到跨膜信号转换需要GTP的存在。
试验中发现在破损的细胞中,外源GTP对于激素激活或抑制腺苷酸环化酶是必需的。
以后,Gilman等人发现S49G蛋白缺失突变细胞系Cyc-尽管具有正常水下的受体和环化酶,肾上腺素仍不能激括环化酶;如果将这种不能偶联的细胞中的质膜制剂与用去污剂从正常细胞中制备的G蛋白混合在一起,就可以重组需GTP的对激素敏感的腺苷酸环化酶体系.而G蛋白在该突变系中是缺失的。
最近,利用提纯的肾上腺素受体,Gs(刺激型G蛋白,因它的活化可以刺激环化酶的活性而得名)和腺苷酸环化酶就可以在合成的磷脂囊泡上重组有活性的肾上腺素激活的腺苷酸环化两系统,这也说明整个信号偶联体系不再需要其它蛋白质了。
这些工作阐明了细胞外信号如何转换为细胞内信号的机制,因此1994年医学生理学诺贝尔奖授予在G蛋白发现过程中作出重要贡献的A.G—Gilman和M.Rodbell。
本章主要讨论与细胞信号传递有关的异三聚体G蛋白和“小G蛋白”的一殷作用模式,对其中某些个别成员在信号传递中的具体作用,详见后面有关章节。
1.异三聚体G蛋白
一般把异三聚体G蛋白简称为G蛋白,只是要明确区分了其它GTP结合蛋白时才使用其全称,因此,在本书的讨论中如果没有特别说明,那么G蛋白一般是指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白。
1.1异三聚体G蛋白的基本结构
提纯的各种G蛋白在溶液中分子量约为100KD左右,在SDS电泳中可看出它由α、β、γ三种亚基组成,而在天然电泳中β与γ亚基仍紧密联系在一起。
。
亚基分子量在39-46kD之间,各种G蛋白亚基中,α亚基差别最大,因此,α亚基就被用作G蛋白的分类依据。
其共同的特点是具有一个GTP结合位点,本身具有GTP酶的活性,即可以把GTP水解成GDP和无机磷酸;在某些G蛋白的α亚基上,有些特殊的氨基酸(Arg或Cys)残基可被特定的细胞毒素所修饰,从而调节其生理功能。
已经克隆了几个Gα的cDNA,揭示了G蛋白一级结构中几个高度保守的结构域,即P区域、G'区域和G区域。
P与G区域都与GTP结合及GTP酶活力有关;G区域则与GTP结合,并与腺苷酸环化酶相互作用有关。
另外也了解到与受体接触的是Gα的C端α螺旋等。
β亚基分子量为36kD左右,各种G蛋白的β亚基在肽图(pepttidemapping)和免疫化学特性及氨基酸序列方面很相似,γ亚基分子员在7—8kD之间.各种G蛋白之间γ基也比较相似但个别的也有些区别:
它可与β亚基非共价紧密结合。
G蛋白在结构上没有跨膜蛋白的特点。
它们能够固定于细胞膜内侧,主要是通过对其亚基上氨基酸残基的脂化修饰作用(lipidmodification),例如γ亚基上的某些氨基酸残基的异戊烯化(prenyIation)、一些α亚基上的肉豆蔻酰基化(myridtoylation)作用,这些修饰作用即可把G蛋白锚定在细胞膜上。
1.2异三聚体G蛋白的种类
到目前为止至少有21种不同的α亚基,4种β亚基和7种γ亚基已分离鉴定(表4.1),它们大部分是通过分子克隆的方法获得的。
过去对G蛋白的研究结果往往是通过用一般的生化方法分离提纯的G蛋白获得,对其分类主要是根据它们的功能,即它们对靶菌(或分子)作用的结果(如激活或抑制),如把能够激活腺苷酸环化酶的G蛋白称为Gs,而对该酶有抑制作用的称为Gi。
由于普通生理生化研究方法的局限性,对G蛋白分离纯化的种类毕竟有限,因此,对它们功能的了解也有限。
日前用分子克隆的手段获得的G蛋白,不但对其一般生理生化特点进行研究,而且还可以获得其氨基酸序列,因此可以根据它们的序列进行分类、但结果在分类上就产生了一定的混乱。
如Gs亚种中的成员在结构上属于一类,但其作用不一定是激活,如Gs—1可以激活Ca2+通道,然而对Na+通道却有彻制作用。
同样的情况也存在于Gi亚族中。
为了便于讨论和与以前教科书中名称的统一,仍沿用过去的表示方法,即Gs,Gi,Gt等。
值得注意的是其涵义已不限于“激活”或“抑制”。
按目前的分类方法,实际上往往更倔重于每类G蛋白在结构和进化亡的相似性。
Gs型G蛋白主要是激活型受体与腺苷酸环化酶之间的偶连蛋白,配体与受体结合后可以通过Gs型G蛋白徽活腺苷酸环化酶,而加速cAMP的产生。
到目前为止,已经有5种腺苷酸环化酶被分离鉴定,它们都可被Gs激活。
其中,Gs—0lf特异地在嗅觉神经表皮细胞中表达,可以激活与嗅觉受体偶联的腺苷酸环化酶。
Gs除了激活腺苷酸环化酶外,还可以激活钙通道,而对钠通道则有抑制作用。
Gs-s与Gs-l分别代表Gs的短式(分子量44.2kD)与长式(45.7kD),它们是由同一前体mBNA经不同密切而成。
同一胞外信号能使cAMP增加,或使其减少,这决定于信号所结合的受体类型。
例如:
肾上腺有β受体和α受体二种受体,前者为激活型受体(Rs).可以激活腺苷酸环化酶,后者反之,为抑制型受体(Ri)。
β受体与Gs偶联产生效应,而α2受体与Gi结合从而抑制环化酶活性,导致脑内cAMP水平下降。
由于这类G蛋白最早被发现是对其靶酶(腺苷环化酶)具有抑制作用,因而被称为抑制型G蛋白(Gi)。
Gt(transduccin,转导素)是在视觉细胞中发现的,视网膜感光细胞可以将光能转换为神经冲动,一定波长的光子像激素配体一样作用于感光色素蛋白受体(如视杆细胞上的视紫红质)上,同样激活了Gt,后者继而激活cGMP—PDE酶,使cGMP浓度降低,起胞内信使传递光信号作用。
Go是在提纯脑组织中G蛋白的过程中发现的,它们调节磷脂代谢,因而可能与肌醇磷酸信号系统行关。
最近、在味蕾组织中发现了一种特异的G蛋白——GR,虽然对其详细的功能尚不了解,但它具有极高的组织特异性,说明可能与味觉有关。
从以上外论的这些蛋白可以看出,从功能上来讲,它们的作用并不一定是抑制作用。
但是,从氨基酸顺序上来看。
却与Gi相近,所以从结构上部属于Gi类。
过去常将与钾通道、钙通道有关的G蛋白友尔为Gk、Gca等,根据它们的氨基酸顺序则分别将其归人Gs或Gi类(表4.1)。
最近还发现了另一类与磷脂代谢有关的G蛋白,但与Go不同,它们的活性并不受细胞毒素的修饰,称为GQ。
1.3异三聚体G蛋白与细胞信号跨膜转换模型
1.3.1Gs的调节作用模型
Gs是指激活型受体与腺苷酸环化酶之间的偶联蛋白,是G蛋白中结构功能了解得比较清楚的一种。
其作用模型可用图4.1说明。
当Gs处于非活化态时,它为异三聚体。
α亚基上结合着GDP,此时受体及环化酶亦无活性;激素配体与受体结合后导致受体构象改变,其上与Gs结合位点暴露,受体与Gs在膜上扩散导致两者结合。
形成受体-Gs复合体后,Gsα亚基构象改变,排斥GDP,结合了GTP而活化,α亚基从而与βγ亚基解离,同时暴露出与环化酶结合位点。
亚基与环化酶综合而使后者活化,利用ATP生成cAMP;一段时间后,α亚基上的GTP酶活性使结合的GTP水解为GDP,亚基恢复最初构象,从而与环化酶分离,环化酶活化终止,α亚基重新与βγ亚基复合体结合。
如有胞外信号配体与受体结合,以上过程重复进行,环化酶再次被激活;否则受体、Gs和环化酶即恢复原初非活性状态。
总之,在上述模型牛。
Gs穿梭于膜上两个蛋白质——受体与腺苷酸环化酶之间,起了一个信号传递者的作用,而Gs上结合GTP—GDP循环在激活-灭活环化酶中起丁关键作用。
利用一种非水解的GTP类似物GMP—P(NH2)P,来代替GTP所进行的研究,为上述模型提供了一个重要的实验证据。
GMP—P(NH2)P的结构式为:
其中,—P(NH2)P取代了GTP末端的磷酸二酯键。
GMP—P(NH2)P可与Gs结合,但不能被水解。
将其与刺激型激素一起加入红细胞膜制剂中,导致比GTP加刺激型激素所引起的环化酶活化反应更强烈、更持久,其原因即为GMP—P(NH2)P不能被水解,α亚基始终结合于环化酶,将其“锁定”在活化状态。
细胞毒素对于确定G蛋白的作用非常有价值。
霍乱毒索(choIeratoniH)是由霍乱杆菌产生的肽;霍乱的症状是严重腹泻,患者脱水死亡。
霍乱毒素由两种肽链组成,其一是ADP—核糖转移酶,它可穿过细胞表面进入细胞质,催化胞内NAD+的ADP核糖基共价结合到Gs的α亚基的修饰拉点上(图4.2);这种α亚基不可逆地修饰,使它可与GTP结合,但丧失了GTP两活性,GTP不能水解为GDP,因此活化α亚基始终结合在环化酶上,同样使其长久活化,细胞质中cAMP增加了100倍以上,导致膜蛋白让大量水分进入肠腔,造成严重胶泻。
以上事实的阐明不仅弄清了霍乱疾病机制,也为G蛋白作战模型提供了进一步证据。
图4.1受体通过G蛋白与cAMP环化酶偶联的模型(据B.Alberts等)
图4.2细菌毒素催化从NAD+转移ADP-核苷酸基团到Gs蛋白α亚基(据J.Darnell等)
1.3.2Gi的调节作用摸型
肾上腺素α2受体与Gi(抑制型G蛋白)结合从而抑制环化酶活性,导致胞内cAMP水平下降。
Gi与Gs的βγ亚基相同,但α亚基不同。
当α2受体与Gi结合时,翻结合GTP以代替GDP,从而使Gi的α亚基与Giβγ分离。
至于抑制原理,一种假设是GiGiβγ水平的增加,增强了Gs的βγ亚基与Gsα亚基的结合,使Gs活化逆转,间接地抑制了环化酶的活性;另一种及见是根据S49淋巴溜Gs缺失的cyc-突变株的细胞实验结果,认为Gi活化产生的α亚基只能是与环化酶结合而直接抑制它。
cyc-突变株细胞由于缺失Gs而成为研究Gi调节作用的有用材料。
百日咳毒素(pertussistoxin)则可性化GiaADP核糖化,可能造成Gi不能结合GTP,使Gia不能活化,阻断了Ri受体引起的对腺苷酸环化酶的抑制作用。
也可能是抑制了Gi与Ri的相互作用,从而抑制Ri的作用。
百日咳毒素所引起的病理症状,是否能用其阻断Ri对腺苷酸环化酶的抑制作用来解释,尚不清楚。
1.3.3Gβγ的调节作用模型
过去认为G蛋白βγ亚基的功能主要是对G蛋白功能的调节和修饰以及把G蛋白锚定在细胞膜上,但现在发现,在某些情况下G蛋白被受体激活后Gβγ亚基也可直接激活胆内的靶分子。
在酵母(S.cerevisiae)中,异性的双倍体在繁殖过程中需要一种称为α因子的多肽(α-matingfactor)。
当α因子与异性菌株的受体结合后,与G蛋白作用使α和βγ亚基解离,但与经典的动物细胞中G蛋白的作用模式不同,激活靶酶的不是Gα亚基,而是Gβγ复合体。
这一结果通过分于遗传方法得以证明:
在去掉编码βγ亚基基因的菌中,依赖于α因子的繁殖过程不能进行,但如果去掉编码α亚基的基因,该繁殖过程则不受影响。
研究表明,在某些哺乳动物细胞中,G蛋白的βγ亚基复合体也可以直接激活靶分子。
在脑细胞中有3种不同的腺苷酸环化
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