分子克隆技术实验操做手册2005.pdf
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分子克隆技术实验操做手册2005.pdf
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分子克隆技术分子克隆技术实验操作手册实验操作手册20052005生命科学技术学院生命科学技术学院1课程简介课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧,主要包括分子克隆和分子杂交两大部分:
分子克隆技术:
DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段,通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术:
实验室常用的分子杂交技术主要有Southernblotting,Northernblotting,Westernblotting及Dotblotting等。
Southernblotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA,经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段,随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上(硝酸纤维素膜或尼龙膜)。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变,用一定方法(如放射性同位素)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA杂交,经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置,然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。
为让学生初步了解有关RNA的操作过程注意事项,我们还列出Northernblotting的操作步骤以供选择。
2目目录录系列一分子克隆技术.4实验一质粒的制备.4实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳.5实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆.7实验四感受态细胞的制备.9CaCl2感受态细胞的制备实验步骤.9电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤.10实验五质粒的转化及转化子的鉴定.11热激法转化实验步骤:
.11质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤.12实验六PCR技术.12系列二Southern杂交技术.14实验一植物总DNA的快速少量抽提(CTAB法).14实验二总DNA质量检测及酶切.15实验三电泳、转膜.16实验四SouthernBlotting.18系列三NorthernBlotting.24实验一RNAExtraction(miniprep).24实验二RT-PCR(ReversetranscriptionPCR).26实验三RNA的电泳,转膜和杂交.28附录试剂配方.29一细菌培养试剂.30二质粒抽提试剂.303三DNA操作试剂.31四RNA操作试剂.34StockSolution:
.34WorkSolution.354系列一系列一分子克隆技术分子克隆技术实验一实验一质粒的制备质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:
细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程。
实验目的:
实验目的:
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
实验材料:
实验材料:
含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液,克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。
实验原理:
实验原理:
在pH12.012.6碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。
通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
实验步骤:
实验步骤:
1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37过夜培养;2.用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有Amp抗生素的LB培养基中,37摇床250r/min过夜培养;3.吸取1.5ml菌液,12000g离心2分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净;4.加入300l溶液I振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:
应彻底打匀沉淀或碎块);5.加入300l溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟;6.加入300l溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;7.12000g离心10分钟;8.吸取800l上清液(注意:
不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;59.12000g常温离心15分钟;10.倒尽上清,加75乙醇浸洗除盐(放置片刻或离心3分钟后倒去上清);11.室温放置或超净台上风干DNA;12.加40l灭菌超纯水或TE溶解;13.质粒、BAC的质量检测,于-20保存。
附注:
附注:
质粒检测电泳检测:
质粒电泳一般有三条带,分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测:
采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值,若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之间,说明质粒质量较好,1.8为最佳,低于1.8说明有蛋白质污染,大于1.8说明有RNA污染。
实验二实验二DNDNAA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
实验目的:
实验目的:
掌握琼脂糖凝胶电泳的原理,学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
实验材料:
实验材料:
质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。
实验原理:
实验原理:
在pH值为8.08.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
实验步骤:
实验步骤:
1用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;2调整好梳子的高度;3称取0.24g琼脂糖于30ml0.5TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷6却至45-50C时倒入制胶板中;4凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;5将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;pUC185l+ddH2O3l+溴酚蓝2l共10l于0.5mltube中混合后点样;6将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;7电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5g/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色1015min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。
附注:
附注:
1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:
1)DNA分子大小迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。
分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。
分子越大,迁移越慢。
等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋线性DNA)2)琼脂糖浓度:
logU=logU0Kr胶浓度,U为迁移率,U0为DNA的自由电泳迁移率,为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。
不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNAAgarose:
0.5%:
1-30kb;0.7%:
0.8-12kb1.2%:
0.4-7kb;1.5%:
0.2-3kb.3)DNA构象:
一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。
当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
4)所加电压:
低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm5)碱基组成与温度:
一般影响不大4-306)嵌入染料的存在:
降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)7)电泳缓冲液(0.5TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1TAE,1TBE,1TPE(均含EDTApH8.0)。
2溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。
3电泳指示剂:
核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylenecyanol,Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
7实验三实验三外源外源DNADNA片段在质粒载体中的克隆片段在质粒载体中的克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。
DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。
实验目的:
实验目的:
学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接,将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。
实验材料:
实验材料:
外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段;克隆载体为PUC18。
实验原理:
实验原理:
限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段,经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。
实验步骤:
实验步骤:
1载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切:
(50l反应体系,用1.5mltube,冰上操作):
DNA30lR.E1l10buffer5lddH2O14l37反应1hr,分别取8l外源片段酶切产物和5lPUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全;按25步纯化、回收DNA2加入ddH2O150l(扩大体积),加入等体积氯仿/异戊醇(24:
1),颠倒混匀,12000g离心10min;3吸取上清,加1/10体积3MNaAc和两倍体积无水乙醇,-20放置15分钟以上;412000g4冷冻离心15分钟;5倒去上清,用75乙醇浸洗沉淀,风干后外源DNA溶于10lddH2O(0.5mltube中),PUC18溶于20lddH2O(1.5mltube中);6按以下反应去除载体PUC18的5磷酸基团,50反应30min以上DNA20lCIAP(TaKaRa)0.5l10buffer4.0l8ddH2O15.5l770水浴10min,使CIAP失活;8按25步纯化载体,溶于10lddH2O;9连接反应(15l体系):
DNA10lpUC182.5l5buffer1.5lT4ligase(3U/l)1l16水浴过夜10转化大肠杆菌感受态细胞11转化子的鉴定附注:
附注:
1.根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载
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- 分子 克隆技术 实验 手册 2005