AMRS-PCR原理_精品文档.pdf

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鑫诺美迪ARMSPCR产品原理与应用肿瘤细胞突变相关基因技术部北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司BeijingSinoMDgeneTechnologyCO.,LTD.鑫诺美迪产品原理与应用目录目录一、检测方法及原理二、流程与具体操作三、结果分析及解读四、背景及应用一、检测方法及原理基本原理：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。

但由于Taq酶的5端3端外切酶活性外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步基本原理：

附加错配突变设计在3端引物序列中，若出现错配则不会出现扩增出现错配则不会出现扩增，如此引物仅仅识别突变序列，而不识别正常序列识别突变序列，而不识别正常序列。

仪器通过检测反应孔中的荧光信号，而达到检测相关已知突变基因型已知突变基因型的目的。

一、检测方法及原理检测方法：

ARMSPCR法扩增受阻突变系统（AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS）配制配制PCR反应体系反应体系加样加样上机进行上机进行PCR反应反应检测荧光信号检测荧光信号得出结果得出结果核酸提取核酸提取具体流程：

二、流程与具体操作1.配制PCR反应体系试剂盒主要组成成分产品组成产品组成主要成分主要成分6人份规格及装量人份规格及装量24人份规格及装量人份规格及装量PCR反应液dNTP、Mg2+、Taq酶等600L1管1200L2管引物探针混合液1引物、探针39L1管156L1管引物探针混合液2引物、探针39L1管156L1管.引物、探针39L1管156L1管引物探针混合液（W）引物、探针39L1管156L1管阳性质控品P无生物活性基因片段80L1管80L1管阴性质控品P纯化水1000L1管1000L1管内标质控品无生物活性基因片段160ul1管160ul1管二、流程与具体操作注：

一种引物探针混合液检测一种或一类突变型，根据不同项目有不同数量。

PCR反应液引物探针混合液纯化水12.5N6.5N4N试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒；将上述混合液23L/管分装至PCR反应管中（无菌和RNase-Free）。

1.配制PCR反应体系二、流程与具体操作提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用；确定反应数N，N=待检样本数（n）+质控品数

（2）+1；计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下：

2.核酸提取二、流程与具体操作样本要求：

样本要求：

用量：

每例标本切5张（10m）白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5mlEP管中；质量：

为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内2年以内的石蜡标本；标本收集方法：

石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色片子一张（在显微镜下肿瘤细胞比例70%肿瘤细胞比例70%）；2.核酸提取二、流程与具体操作核酸提取：

核酸提取：

推荐使用商品化的试剂盒来提取人类基因组DNA（如QIAGENQIAampDNAFFPETissueKit（CatNO.56404），提取过程请参考相应说明书；核酸纯度要求：

核酸纯度要求：

提取DNA需要紫外分光光度计测定浓度，样品无蛋白或RNA污染，OD260/OD280=1.82.0OD260/OD280=1.82.0,OD260/OD2302.0OD260/OD2302.0；核酸浓度要求：

核酸浓度要求：

提取的标本必须50ng/L，上样浓度2550ng/ul提取的标本必须50ng/L，上样浓度2550ng/ul注：

建议提取最后一步，过柱洗脱体系不少于200L不少于200L，以免存在过多的PCR抑制物影响后续的步骤。

提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20保存-20保存。

3.加样二、流程与具体操作将已处理样本、阳性质控品P和阴性质控品P下表加样量加入PCR反应管中，盖紧管盖（若出现气泡轻弹管壁至气泡消失），2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应若加样后有气泡残留，可轻弹管底后再离心，以消除气泡。

推荐加样与排版方式：

二、流程与具体操作3.加样推荐加样与排版方式：

二、流程与具体操作3.加样推荐加样与排版方式：

二、流程与具体操作3.加样反应条件：

二、流程与具体操作4.上机注：

该反应条件适用于我司所有DNA检测产品（延伸时间可能适当延长）注：

该反应条件适用于我司所有DNA检测产品（延伸时间可能适当延长）三、结果分析及解读质量控制：

质量控制：

1.阴性质控品P：

靶基因通道无S型扩增曲线。

2.阳性质控品P：

靶基因通道有S型扩增曲线，且Ct值30。

以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。

阳性阴性外控突变型不存在的突变型三、结果分析及解读结果分析：

结果分析：

突变结果分析：

依次确定个反应管突变Ct值（CtM）和外控Ct值（CtW），计算Ct值=CtM-CtW，若实验室要求环境要求：

环境要求：

独立，完善的分子实验室：

临床基因扩增实验室应该分为以下三个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区）、并且各个区域应具备普通分子实验的基本配置。

人员要求：

人员要求：

操作人员应经过以下专业培训，具有合格的操作技能方能上岗。

（a）本产品说明书要求的操作培训。

（b）临床基因扩增实验室各个区域仪器设备的操作培训。

（c）微生物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例法规的安全防护培训。

仪器要求：

仪器要求：

荧光定量PCR仪、高速离心机、微型离心机（带八联排转头）、漩涡振荡器个体化治疗基本背景：

必须强制管理假设的省文物标记应用与临床试验，但是那种“一处突变，一种疗法”的观念可能太简单了“一处突变，一种疗法”的观念可能太简单了。

我们需要知道既定通路或类似通路所有可能的基因改变情况，从而预测靶向治疗的疗效。

BoudewijnBraakhuisProfessor,ESMO2012（欧洲肿瘤内科学会）个体化治疗的目标是：

通过对合适的人给予正确的联合用药方法对合适的人给予正确的联合用药方法，实现以促进肿瘤生长和生存畸变为靶点的治疗。

由于对潜在肿瘤恶化几只和药物敏感性认识的增加，以及日益使用的靶向疗法和符合成本效益的多路服用实验，因此以癌症个体化治疗作为医疗标准这一方案最终提交的时间似乎刚好。

如何应对肿瘤个体化治疗的挑战,ESMO2012（欧洲肿瘤内科学会）现在比以往任何时候都更需要合作，科学家、临床医生和患者之间的合作科学家、临床医生和患者之间的合作，以进一步推进各种靶向疗法的发展和为肿瘤童工最有效的治疗。

MichaelP.Link，MDASCOPresident，2012第48届美国临床肿瘤学会年会（ASCO2012）主席MichaelP.Link四、鑫诺美迪产品背景及应用肿瘤相关通路示意图肿瘤相关通路示意图表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸蛋白激酶，其广泛分布于细胞表面，通过受体酪氨酸蛋白激酶RasRafMAPK信号通路对细胞的生长、增值和分化等生理过程发挥重要作用。

EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能确实或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、免疫缺陷及心血管疾病等发生。

EGFR信号通路重要靶标的检测机靶向也治疗一直是国际肿瘤个体化医疗领域关注的焦点。

四、鑫诺美迪产品背景及应用用于治疗的药物用于治疗的药物目前针对EGFR的靶向药物类型有几种，其中EGFR-TKI药物在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）临床疗效明显，已被推荐为晚期患者的一线药物。

目前NSCLC患者最有效的EGFR-TKI药物包括吉非替尼（Gefitinib易瑞沙）和厄洛替尼（Erlotinib特罗凯），但并非对所有患者有效。

EGFR外显子18、19或20发生突变的患者，吉非替尼的的有效率可高达80%，而野生型患者基本无效。

EGFR敏感突变是药物有效的前提。

四、鑫诺美迪产品背景及应用定位：

定位：

专注分子诊断领域，提供卓越的产品和一流的服务使命：

使命：

提升医疗诊断水平，促进人类健康事业发展价值：

价值：

市场向导成就客户优势互补合作共赢爱岗敬业诚信正直结果向导赢在执行