分子生物学实验教学教案.docx
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分子生物学实验教学教案
河南科技大学
实验教学教案
课程名称分子生物学
指导教师李市场
河南科技大学实验教学教案首页
实验名称
实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验学时
4
每次实验组数
6
每组人数
5
实验类型
综合性
实验目的和要求:
通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
实验设备及器材:
控温摇床(37℃),高速冷冻离心机,水浴锅,冰箱(-20℃,‐70℃)
超净工作台,培养箱(37℃),752分光光度计,灭菌锅等。
实验原理:
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择培养基上。
实验内容:
将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
将已经转化的细胞在选择培养基上进行筛选。
学生实验报告要求:
实验报告要求把每个实验步骤都进行分析。
注意事项:
无菌操作
低温操作
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验目的通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
实验原理将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:
1.细胞生长状态和密度:
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2.质粒的质量和浓度:
1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
3.试剂的质量:
所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4.防止杂菌和杂DNA的污染。
本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。
由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC19,则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pUC19。
转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。
一.仪器控温摇床(37℃)高速冷冻离心机
水浴锅冰箱(-20℃,‐70℃)
超净工作台培养箱(37℃)
752分光光度计灭菌锅
二.试剂CaCl2无菌水,冰
胰蛋白胨酵母粉
AmpNaCl
三.其他用品
移液器,枪头
1.5ml,50ml离心管三角瓶500ml200ml
6cm平皿试剂瓶60ml
量筒烧杯
琼脂甘油
酒精灯三角玻棒
酒精棉球火柴
[溶液配制]0.1mol/LCaCl2溶液配置灭菌
LB液体培养基
氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成50_60mg/mL溶液,抽虑灭菌置-20℃冰箱中保存。
四.材料E.coli.DH5α
质粒DNA
五:
实验步骤:
(CaCl2)(20人一班,分三组)
第一天:
从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中,37℃振荡培过夜。
第二天:
1.取0.5mL菌液转接到一个含有50mLLB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养
2-3h(此时,OD600≤0.4-0.5,细胞数务必≤108/mL。
此为实验成功的关键)
3.将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min。
4.离心10min(4000r/min),回收细胞。
4℃
5.倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽。
6.用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL悬浮沉淀,立即放在冰上30min。
7.0-4℃6000r/min,离心10min,回收细胞。
8.用冰冷的0.1mol/LCaCl22mL悬浮细胞,(务必放在冰上)。
9.分装细胞,每200μL一份。
此细胞为感受态细胞。
转化:
10.取200μL新鲜制备的感受态细胞,加入DNA2μL(50ng)混匀冰上放置30min。
同时作两个对照管
受体菌对照:
200μL感受态细胞+2μL无菌水
质粒对照:
200μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA溶液
11.将管放到42℃循环水浴1-2min。
12.冰浴2min。
13.每管加800μLLB液体培养基,37℃培养1h(慢摇)。
14.将适当体积(200μL)已转化的感受态细胞,涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。
15.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。
16.计算转化效率
关于大肠杆菌感受态细胞的制备及转化讲解:
1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如:
电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。
因操作简便,愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株,OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右。
(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降。
一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
⑶、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。
⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
实验名称
实验二、质粒DNA的提取及其酶切
实验学时
4
每次实验组数
6
每组人数
5
实验类型
验证
实验目的和要求:
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。
实验设备及器材:
微量移液器,微量离心管,常用玻璃器皿,恒温培养箱,恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅
实验原理:
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互缠绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那木迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验内容:
用碱裂解法提取质粒DNA
学生实验报告要求:
分析实验的每一个步骤。
注意事项:
1、时间要严格控制;2、注意实验所用的温度。
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实验二、质粒DNA的提取及其酶切
实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。
实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质
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