构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab.docx
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构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab
构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab
作者:
王臣侯利华杜桂鑫李建明陈溥言童贻刚
【关键词】噬菌体抗体库;,,整合素ανβ3;,人源化Fab
[Abstract]AIM:
ToconstructphageantibodylibrarywithpredeterminedCDR3andtoscreenhumanizedFabofantihumanintegrinανβ3monoclonalantibody(mAb)byepitopeguidedselection.METHODS:
LCDR3geneofmAbE10wasinsertedintohumanlightchainvariableregiongenelibrary.HybridphageantibodylibrarywasconstructedbycloningE10chimericFdgeneandhumanlightchainvariableregiongeneintopComb3.Humanizedlightchaingenewasobtainedbyscreeningagainsthumanintegrinανβ3.Likewise,humanizedFabweregainedbypanninghumanphageantibodylibrary,whichwasconstructedbycloninghumanizedlightchaingeneandhumanheavychainFdgenewithE10HCDR3intopComb3.RESULTS:
ThreehumanizedFabcloneswasobtainedbyscreeninghybridphageantibodylibraryandhumanphageantibodylibrary,whichcontained2.1×106,2×107colonyformingunits,respectively.IndirectELISAandcompetitiveinhibitionELISAanalysisdemonstratedthatthreehumanizedFabantibodyhadspecificbindingactivitywithhumanintegrinανβ3.Thestrongestantihumanintegrinανβ3reactiveD5clonewassequencedandsequencinganalysisshowedthattheVκandVHwerederivedfromVKIIIandVHI,respectively.CONCLUSION:
HumanizedFabofantihumanintegrinανβ3mAbhasbeensuccessfullyobtainedbyphagedisplaytechnologywhichlaysthefoundationforfurtherclinicalresearch.
[Keywords]phageantibodylibrary;integrinανβ3;humanizedFab
[摘要]目的:
构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。
方法:
将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。
再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。
结果:
分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。
经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。
结论:
利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。
[关键词]噬菌体抗体库;整合素ανβ3;人源化Fab
鼠源单克隆抗体(mAb)为人类疾病的研究起到了重大的推动作用,但由于其应用于人体易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,严重限制了其临床应用。
噬菌体抗体库技术作为抗体技术领域中的一项革命性进展,该技术自建立之日起就得到了广泛应用。
目前也被公认是制备抗体的高效技术平台[1,2]。
同时该技术也为鼠mAb的人源化提供了新的方法。
Jespers等[3]报道的抗原表位导向选择法的优越性,在于其可获得和原来鼠mAb针对同一表位的完全人源抗体。
王卓智等[4]曾运用该方法对抗TNFα鼠mAb进行人源化,但所获人源mAb的特异性和亲和力难以得到保证,在实验中常常难以获得满意的人源抗体。
Rader等[5]利用上述抗原表位导向选择法构建了预设的抗体库,经对抗整合素ανβ3鼠mAbLM609进行人源化改造,取得了良好的效果。
即先用鼠Fd片段基因与含有鼠mAbLCDR3的人轻链基因配对构建杂合噬菌体抗体库,筛选人源化轻链。
然后再用筛到的人源化轻链与含有鼠mAbHCDR3的人Fd基因配对构建人源抗体库,筛选人源mAb基因。
该方法对人抗体可变区基因文库进行了预设,将原鼠mAb的CDR3基因预先重组到人可变区文库中。
由于可变区的CDR3是决定抗体特异性的关键部位,因而使可变区文库中模拟亲本鼠mAb的能力大大提高,并易与筛到可与亲本鼠mAb形成理想配对的人可变区基因。
本研究中,我们利用抗原表位导向选择方法,对1株抗人整合素ανβ3鼠mAbE10进行了人源化改造,成功地筛选到3株人源化Fab片段。
1材料和方法
1.1材料噬菌粒pComb3、大肠杆菌XLIBlue及辅助噬菌体VCSM13,均为本室保存。
含人源抗HBsAg抗体轻、重链全长基因的双表达质粒B4HFLF为本室构建。
抗人整合素ανβ3杂交瘤细胞株E10及抗人整合素ανβ3鼠mAb(效价1∶2000)由军事医学科学院基础医学研究所孙启鸿研究员惠赠。
抗人整合素ανβ3单链抗体(scFv)和鼠人嵌合Fab噬菌体抗体由本室构建和表达[6,7]。
人整合素ανβ3蛋白购自美国Chimcon公司。
HRP标记的抗VCSM13mAb及淋巴细胞分离液FicollPaqueTMPLUS,购自AmershamPharmacia公司。
人脐带静脉血取自解放军301医院。
1.2方法
1.2.1RNA提取及PCR扩增取人胎盘脐带静脉血100mL,用淋巴细胞分离液FicollPaqueTMPLUS分离人淋巴细胞,并按TRIzolRegent试剂盒的说明书提取细胞总RNA,依试剂盒制备cDNA。
引物参照文献[5,8]设计,稍作改动。
具体引物序列可参阅文献[9]。
PCR扩增人抗体VH及VLFR1FR3基因的条件为:
94℃变性15s,52℃退火20s,72℃延伸60s,共30个循环。
1.2.2含鼠mAbCDR3的人轻链和Fd基因库的构建以B4HFLF载体为模板,用引物CR501及CR301扩增人VHFR3鼠HCDR3人VHFR4CH1基因片段。
分别以引物CκR5、CλR5与CκR3配对,扩增人VκFR3鼠LCDR3人VκFR4Cκ和人VλFR3鼠LCDR3人VκFR4Cκ基因。
将所获基因片段,分别与上述PCR扩增的各种组合人抗体VH及VLFR1FR3基因逐个配对相互融合。
重链Fd基因融合的PCR条件为:
取人VHFR3鼠HCDR3人VHFR4CH1基因及人抗体VHFR1FR3基因各15ng为模板,分别以VHsenseprimers和CR301为引物于94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸60s,共25个循环。
分别将各种引物组合所扩增的融合PCR产物混在一起即为构建的含鼠HCDR3的人重链Fd基因库。
轻链融合条件同上类似于扩增κ链及λ链的PCR产物,混合后即为构建的含鼠mAbLCDR3的人轻链基因库。
具体操作过程可参照文献[9]。
1.2.3噬菌体抗体库的构建及鉴定本研究分别要构建鼠人嵌合Fd人轻链杂合噬菌体抗体库及人源噬菌体抗体库。
杂合抗体库的构建:
将鼠人嵌合Fd基因和人轻链基因库分别经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切后,重组到噬菌粒pComb3载体中。
以其电转化大肠杆菌,经辅助噬菌体超感染后收集上清即为噬菌体抗体库。
人源抗体库构建原理与此相同。
噬菌体抗体库的构建及鉴定具体操作过程参照文献[10]。
1.2.4噬菌体抗体库的筛选及单克隆噬菌体抗体的制备参照文献[11],以8.7mg/L的人整合素ανβ3蛋白包被酶联板,于4℃过夜。
加含30g/L的BSA的PBS于37℃封闭1h,洗板后加100μL噬菌体抗体库(约1012cfu),于37℃2h。
以TBST洗1次(第2轮洗5次,第3轮后洗10次,每次5min),加100μL洗脱液(0.1mol/L盐酸,甘氨酸调pH至2.2,加BSA至1%)回收噬菌体,经3mL中和缓冲液(2mol/LTris)调节pH至中性后感染2mL细菌,进行下一轮筛选,共进行4轮筛选。
从第3轮和第4轮淘筛后,铺平板培养后,各挑取20个单个菌落接种于2mLSB培养基中,于37℃培养至A600=0.5~0.6。
加20μLVCSM13,于37℃培养2h后,补加卡那霉素至70mg/L,过夜培养,次日收集上清即为噬菌体抗体。
1.2.5噬菌体抗体的抗原结合活性用50μL的人整合素ανβ3抗原包被酶联板于4℃过夜。
以100g/L脱脂奶粉封闭2h后,将上述噬菌体抗体与等量脱脂奶粉混合,室温放置30min加入到封闭后的孔内,每孔50μL,于37℃孵育2h。
用PBST洗板3次,加入HRP抗M13抗体,于37℃放置1h。
以PBST洗板3次,加入TMB显色10min(加A液后再加B液各1滴),用50μL2mol/LH2SO4终止反应,用酶标仪测定A450值。
检测中以辅助噬菌体VCSM13作为阴性噬菌体抗体对照。
1.2.6噬菌体抗体的交叉反应性取噬菌体抗体阳性的克隆与不同抗原BSA、HBsAg、木瓜蛋白酶和小鼠IgG进行交叉结合活性鉴定。
即以各种抗原包被酶联板后,其余步骤同间接ELISA。
1.2.7噬菌体抗体的竞争抑制ELISA以人整合素ανβ3抗原包被酶联板,将不同稀释度的鼠抗人整合素ανβ3mAb与抗人整合素ανβ3阳性的噬菌体抗体等体积混合后加入到酶联板中,于37℃孵育2h,其余步骤同间接ELISA。
抑制率={(抑制前的A450值-抑制后的A450值)/抑制前的A450值}×100%。
抑制率>50%者为阳性。
2结果
2.1含鼠mAbCDR3的人轻链和Fd基因库的构建用RIzol试剂一步法从3个新生儿脐血中分离的淋巴细胞中提取总RNA,经测定A260/A280=1.8,表明总RNA的纯度较好。
RN
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