淮海工学院生物化学大实验报告niujun.docx
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淮海工学院生物化学大实验报告niujun
海洋学院
综合大实验报告
专业:
生物技术班级生技121班
姓名:
newjhon学号:
21
题目:
生物化学大实验
指导教师:
孙玉英
2014-2015学年第1学期
2014年12月22日--2015年1月2日
酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响
班级:
生技121姓名:
牛军学号:
20121211111
【摘要】
本实验采用控制变量法分别研究唾液淀粉酶的特异性以及温度、pH对该酶活性的影响,得出结论:
唾液淀粉酶对淀粉有水解作用;在37℃和pH6.8时,酶的作用效果分别是最好的。
【关键词】唾液淀粉酶,温度,pH,特异性
1前言
唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一种水解酶,具有水解可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖,水解α-1,4-糖苷键的酶。
本实验通过比较在不同条件下唾液淀粉酶对淀粉水解后的显色反应颜色的不同,进而了解不同温度、pH对唾液淀粉酶活性的影响以及该酶的特异性。
2材料及方法
2.1材料
主要材料为人的唾液以及淀粉溶液
2.1.1试剂
蒸馏水
NaCl(分析纯,中国上海试剂一厂),
可溶性淀粉(化学纯,广州医药站化学试剂公司),
蔗糖(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),
CuSO4(分析纯,上海试一化学试剂有限公司),
柠檬酸钠(分析纯,中国上海试剂一厂),
无水Na2CO3(分析纯,南京化学试剂一厂),
KI(化学纯,南京化学试剂有限公司),
Na2HPO4·2H2O(分析纯,江苏省连云港市化学试剂厂),
浓HCl(分析纯,南京化学试剂有限公司),
NaOH。
2.1.2配制试剂
①唾液淀粉酶的制备:
用烧杯取蒸馏水或自来水,含于口中,1—2分钟后,吐入50mL烧杯中,备用。
②Benedict试剂
A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中,冷后稀释至150mL;
B、取柠檬酸钠173g及无水Na2CO3100g,加水600mL加热使之溶解,冷后稀释至850mL;
C、将A液缓慢注入B液中,混匀备用。
(可长期保存)。
③pH1.5溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸钠38.8mL,然后用浓HCl调至pH1.5左右;
④pH6.8溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸钠18.2mL;
⑤pH9.8溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸钠2.2mL,然后用0.1MNaOH调至pH9.8左右;
⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液:
称取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于烧杯中,加入200mL水,于电炉上加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直至液体澄清。
待冷却后转移至250mL容量瓶,定容。
⑦0.5%的蔗糖溶液:
称取蔗糖0.5g,加水溶解,定容至100mL。
⑧KI-I溶液:
称取碘化钾3g溶于蒸馏水中,待全部溶解后再加I1g,振荡溶解,定容至100mL。
2.1.3仪器
试管(10支)移液管(7支)
胶头滴管,小烧杯(50,100ml)大烧杯(1000ml)
BP221S型电子天平HW·YS型电子恒温水浴(37℃)
A型50Hz220V—800W双层铁皮电炉石棉网
pH试纸,洗耳球
容量瓶玻璃棒
试管架
2.2实验方法
2.2.1酶的特异性
(1)取两支试管编号①、②,①号加入0.5%的淀粉液2mL,②号加入0.5%的蔗糖液2mL;
(2)与两支试管各加入制备好的唾液1mL;
(3)将两支试管同时放入37℃恒温水浴锅中保温;
(4)15分钟后,取出两试管,各加入Benedict试剂1mL;
(5)将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟;
(6)取两支试管,观察记录颜色的变化,并注意是否有红棕色产生。
表1酶的特异性验证
试剂
管号
①
②
0.5%的淀粉液(mL)
2
—
0.5%的蔗糖液(mL)
—
2
制备好的唾液(mL)
1
1
37℃恒温水浴保温15min
Benedict试剂(mL)
1
1
沸水浴6分钟→观察记录颜色的变化
2.2.2温度对酶活性的影响
①取三支试管并编号①、②、③,同时加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀;
②将管①、管②、管③同时分别放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中;
③15分钟后,取出各管,分别加入碘液数滴,观察并记录各管颜色变化。
表2温度对酶活性的影响
试剂
管号
1
2
3
0.5%淀粉液(mL)
5
5
5
唾液(mL)
1
1
1
水浴(15min)
冰浴
37℃
沸水浴
碘液
数滴
数滴
数滴
2.2.3pH对酶活性的影响
①取试管3支编号6、7、8,按下表加入试剂;
②3支试管同时放入37℃恒温水浴锅内保温;
③15分钟后,取出3支试管,分别加入碘试剂数滴,每加一滴,注意摇匀,观察并记录颜色变化。
表3pH对酶活性的影响
试剂
管号
1
2
③
0.5%淀粉液(mL)
2
2
2
pH1.5溶液(mL)
1
—
—
pH6.8溶液(mL)
—
1
—
pH9.8溶液(mL)
—
—
1
唾液(mL)
1
1
1
37℃恒温水浴保温15min
碘液
数滴
数滴
数滴
3结果与分析
3.1实验结果
3.1.1酶的特异性
实验现象:
①号试管经沸水浴后,试管内颜色仍为蓝色,但在试管底部可以看出有些许砖红色沉淀出现;②号试管经沸水浴后颜色没有发生变化(仍为浅
蓝色。
(如图1)
②号试管①号试管
图1酶的特异性
实验现象表明:
唾液淀粉酶能水解淀粉,而不能水解蔗糖。
说明唾液淀粉酶具有特异性。
3.1.2温度对酶活性的影响
实验现象:
①号试管加5滴碘液并混匀后颜色趋近与碘液原来的颜色,但较②号试管颜色较深;②号试管加5滴碘液并混匀后也趋近碘液本身颜色,但比碘液颜色浅;③号试管加5滴碘液并混匀后变成深蓝紫色。
(如图2)。
1②③
图2温度对酶活性的影响
实验现象表明:
经过冰水浴后,唾液淀粉酶活性降低,但仍能将淀粉分解成葡萄糖;而在37℃条件下唾液淀粉酶活性较高,将淀粉分解成葡萄糖。
说明低温对唾液淀粉酶活性有一定影响。
经过沸水浴后,唾液淀粉酶变性,不能分解淀粉。
3.1.3pH对酶活性的影响
实验现象:
①号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成酒红色;②号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后接近碘液本身的颜色;③号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成浅蓝黄色。
(如图3)。
1②③
图3pH对酶活性的影响
实验现象表明:
pH为1.5(强酸性)条件下,唾液淀粉酶可以水解淀粉;pH为6.8(接近中性)条件下,唾液淀粉酶活性较高,能水解淀粉;pH为9.8(碱性)条件下,唾液淀粉酶仍能水解淀粉,只是较pH1.5和pH9.8相比,酶的活性较弱。
3.2结果分析
本实验研究酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响得到以下结果:
唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖,验证了酶的特异性,与理论相符。
在温度对酶活性影响实验中,由颜色变化可以得出结论:
高温降低酶活性,低温对酶活有较小的抑制作用。
在pH对酶活性影响实验中,得出的结论是:
高pH对酶活抑制较大,低pH对酶活抑制较小。
4讨论
从实验中可以得出结论:
唾液淀粉酶具有高度特异性,其活性受温度、pH值等多种因素影响。
但本组实验所得砖红色沉淀较少,有些实验组没有沉淀产生,导致实验与预期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明显的个体差异,因而为了确定恰当的唾液稀释倍数和反应时间,建议在原实验项目之前增加唾液稀释倍数确定实验。
唾液淀粉酶活性存在明显的性别差异[1]和个体差异,不同个体的酶活性相差达到上百倍,其主要是由于编码该酶的基因在体内的拷贝数差异所决定的[2-3]在进行该实验操作过程中会发现不同同学的唾液淀粉酶活力不同,在实验过程中所用的唾液的稀释倍数也不同。
本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果有差异,且发现有实验证明酶的活性在沸水浴(95℃)中并没有受到影响,反而比恒温水浴(37℃)反应的更彻底[4];本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果不一,需要改进实验方案:
不要检测反应物(淀粉),用斐林试剂检测产物(还原糖)进行判断,且注意斐林试剂的用量为5%HCl用量的2倍[5]。
因此,要进一步探究温度、pH对酶活性的影响,确定酶的最适温度和最适pH,需要更加严格周密的实验方案。
5参考文献
[1]归改霞.性别不同对唾液淀粉酶活性影响的研究.卫生职业
2013,31(24):
110-11
[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhuman
amylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:
1256-1260.
[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.Individual
DifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsand
theperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:
13352.
[4]马彦玲.不同温度影响唾液淀粉酶活性实验操作流程的再改进.河南职工医
学院学报,2013,25(5):
613-616
[5]范淑秋.pH影响淀粉酶活性的探究.生物学通报,2008,43(10):
49-50
血红蛋白凝胶过滤层析
班级:
生技121姓名:
牛军学号:
20121211111
【摘要】
本实验利用SephadexG-25制备凝胶柱,通过凝胶过滤层析的方法,从新鲜鸡血中制备鸡的血红蛋白,经洗脱液不断洗脱最终收集到含有鸡血红蛋白的样液。
【关键词】凝胶过滤层析,血红蛋白,分离纯化
1前言
分离和提纯蛋白质方法多种多样,其中最为重要的两种方法就是电泳和层析,在这些方法中主要是利用蛋白质之间各种特性的差异,包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其他分子的生物学亲和力[1]。
凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法,又称分子排阻层析、分子筛层析等,它是利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(凝胶)为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混合物中的各种物质按其分子体积大小和形状的差异而得到分离,已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定等方面[2]。
凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、分离迅速和不影响样品生物活性等优点,但凝胶过滤层析对蛋白混合物的最佳分离效果受许多因素的影响。
通过本实验的学习,了解凝胶柱层析的原理及应用,掌握凝胶柱层析的基本操作技术,为进一步掌握离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离方法打下良好基础。
2材料与方法
2.1材料
2.1.1实验材料
新鲜鸡血
2.1.2药品
Na2HPO4·2H2O(分析纯,江苏省连云港市化学试剂厂);
NaH2PO4·2H2O(分析纯,天津市福晨化学试剂厂);
蒸馏水;
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);
硫酸亚铁(Fe
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- 淮海 工学院 生物化学 实验 报告 niujun