分解纤维素的微生物的分离.docx
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分解纤维素的微生物的分离
分解纤维素的微生物的分离
栾旭东,张兴敏,周雪霞,闫超,何溢涛
(山东大学生命科学学院2005级生科基地班,济南250100)
摘要:
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质,它能被土壤中某些微生物分解利用,是因为它们能够产生纤维素酶。
本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物,初步鉴定了其形态特征和生理生化特性,为日后更进一步的研究打下基础。
关键词:
纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法
Abstract:
celluloseisthemostabundantpolysaccharideontheearth,whichcanbedigestedbysomemicroorganismsintheearthbecausetheyproducecellulase.Inourexperiment,weisolatedthesemicroorganismsfromtheearthandcheckedupthecells’andcolonies’morphologyandthebioreactionstheycanact.
Keywords:
cellulose,microorganismsintheearth,pureculture,Congoredstaining
资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。
生物质资源是可再生资源,地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011—2.0×1011,是人类社会赖以生存的基本物质资源,其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。
目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。
随着世界人口迅速增长,矿产资源日渐枯竭,开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术,利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品,即化工原料的“绿色化”,具有极其重要的意义和光明的发展前景。
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%~60%能被土壤中的某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。
而要研究这些微生物,首先要将它们从土壤中种类乏多的微生物中分离出来。
1.土壤中纤维素分解菌的分离[2]
土壤有“微生物的天然培养基”之称,同其他生物环境相比,土壤中的微生物数量最大,种类最多。
在富含有机质的土壤表层,有更多的微生物生长。
实验的具体操作步骤如下。
1.1土样的采集
土壤中的微生物,大约70%~90%是细菌。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长,绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。
因此,土壤取样时,一般要铲去表层土。
另外,土样的采集要选择富含纤维素的环境,这是因为在纤维素含量丰富的环境,通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
综合各种因素,本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。
1.2.选择培养
1.2.1富集培养
在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前,先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
富集培养所需要的仪器有:
250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。
选择培养基的制备比例见下:
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉5g
NaNO31g
Na2HPO4·7H2O0.5g
KH2PO40.9g
MgSO4·7H2O0.5g
KCl0.5g
酵母膏0.5g
水解酪素0.5g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml
按上表比例配制50ml选择培养基。
在250ml锥形瓶中装入50ml培养基,放5~6颗玻璃珠,用8层纱布做成瓶塞,将瓶口塞紧,再在瓶塞外包裹两层牛皮纸,用线绳扎紧,在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
称取土样20g,在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。
将瓶置于摇床上,在30℃下振荡培养3~4d,至培养基变浑浊。
1.2.2梯度稀释
所需仪器:
试管(7支)、移液器、枪头。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器:
试管(每只内装9ml蒸馏水)、枪头(黄色、蓝色)。
用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的土壤溶液。
1.2.3刚果红染色法分离(涂布平板)
所需仪器:
无菌培养皿(12个)、涂布器(3个)、移液器、枪头、温箱等。
需要灭菌的仪器:
无菌培养皿(12个)、涂布器(3个)、移液器、枪头。
(1)鉴别培养基的制备
培养基的制备比例如下:
鉴别纤维素分解菌的培养基
CMC-Na5-10g
酵母膏1g
KH2PO40.25g
琼脂15g
土豆汁100ml
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml
按以上比例配制200ml鉴别培养基和10mg/ml的刚果红(CR)溶液,灭菌后,按照每200ml培养基加入1ml的比例往培养基中加入CR溶液,混匀后倒平板,凝固后待用。
(2)涂布平板
将上述已倒培养基的十个平板底面分别用记号笔写上10-4,10-5,10-6三种稀释度(每个稀释度写3个)和一个空白平板(留作对照用)。
然后用移液器分别由10-4,10-5,10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀,室温下静置5~10min,使菌液吸附进培养基。
30℃倒置培养,至菌落长出,产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。
(3)菌落形态观察
1~2d后,平板上长出菌落,并在个别菌落周围出现明显的透明圈。
图表1空白
图表210-4
图表310-5
图表410-6
挑菌2种,根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征记录不同的菌落形态特征。
菌落
大小
形态
干湿
高度
透明度
颜色
边缘
1
中
不规则
湿
隆起
不透明
粉红
波状
2
小
圆形
湿
隆起
不透明
浅黄
整齐
(4)划线分离
将步骤
(1)中的鉴别培养基加热熔化后倒入2个无菌平皿中,凝固后,用接种环挑取(3)中2种菌落在平板培养基上作连续划线。
划线完毕后,盖上皿盖,倒置于温室培养,至长出单菌落。
由此,即从土壤中分离纯化出纤维素分解菌。
2.纤维素分解菌的染色与形态结构观察及菌种保存
2.1染色镜检(革兰氏染色)
基本原理:
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的,而后一些学者在此础上作了某些改进。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是:
先用初染剂结晶紫进行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染。
经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色的主要原理是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别,染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底,吸附染料差,易脱色,这是染色反应的主要依据。
另外,阳性菌菌体等电点较阴性菌为低,在相同PH条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多,因此不易脱去,阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如,在强碱的条件下进行染色,两类菌吸附碱性染料都多,都可呈正反应;PH很低时,则可都呈负反应。
此外,两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小,故不易被脱色,阴性菌透性大,易脱色。
所以脱色时间,脱色方法也应严格控制。
所需仪器或试剂:
菌种1,2的平板培养物、革兰氏染色液(结晶紫碘液,番红染液)、显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、蒸馏水等。
操作步骤:
制片(涂布、干燥、固定)→结晶紫初染1~2min,水洗→碘液媒染1min,水洗→乙醇脱色30s,水洗→番红复染1min,水洗→干燥→镜检,油镜观察
镜检结果:
菌1、2均为革兰氏阴性菌,100x油镜下个体都很小,形似杆状。
图表5菌一(10x100油镜)
图表6菌二(10x100油镜)
2.2菌种保存
重新配制鉴别培养基100ml(配制比例参前),装入4支试管后用牛皮纸包扎好121℃20min灭菌,摆斜面。
将平板中的菌1、菌2移接入斜面培养基保存。
3.生理生化鉴别反应
3.1糖类发酵与氧化实验
绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源,但由于不同的菌存在酶系的差异,因而对糖类的发酵与氧化的能力就有所不同。
有的能利用这种而不能利用那种,有的正相反;有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类,产酸产气,有的则只能产酸而不产气。
酸产生与否,以及是发酵型产酸还是氧化型产酸,可由预先加在培养基中的指示剂(溴百里酚蓝水溶液)呈现出来。
这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好氧的条件下培养,培养基由绿色变黄色为产酸,是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定,如产生气泡或断裂则证明有气体存在。
所需仪器:
试管、接种针、恒温箱等。
操作步骤:
1.糖类发酵及氧化实验培养基的制备
培养基配方
蛋白胨0.2%KH2PO40.03%
NaCl0.5%糖1%
溴百里酚0.003%琼脂0.5~0.7%
PH7.0~7.4
按以上配方配制含不同种类的糖(葡萄糖,蔗糖,淀粉)的培养基各200ml,调PH后110℃灭菌20min。
2.待灭好菌的培养基稍冷却,分装到小试管,。
每种培养基倒10支小试管,冷却至其凝为半固体。
3.接种:
用培养了18~24小时的菌穿刺接种,每种菌每个培养基接4支,其中2支用灭菌的甘油封盖(以隔绝空气,称为闭管),另2支不封为开管。
同时要有不接种的闭管作对照。
4.培养:
置37℃下培养8~16h,1d,3d,7d。
5.观察:
在上述培养时间内观察试管中指示剂的变化情况。
结果:
培养约3天时观察到下面的现象
①号菌
②号菌
淀粉培养基
产酸类型
颜色变化
下部变黄
上部变黄
结论
发酵型
氧化型
是否需O2
现象
甘油封盖的不变色未封盖的变色
甘油封盖的不变色未封盖的变色
结论
好氧
好氧
蔗糖培养基
产酸类型
颜色变化
下部变黄
上部变黄
结论
发酵型
氧化型
是否需O2
现象
甘油封盖的不变色未封盖的变色
甘油封盖的不变色未封盖的变色
结论
好氧
好氧
葡萄糖培养基
产酸类型
颜色变化
上部变黄
上部变黄
结论
氧化型
氧化型
是否需O2
现象
甘油封盖的不变色未封盖的变色
甘油封盖的不变色未封盖的变色
结论
好氧
好氧
用淀粉和蔗糖做出的结果一致,而与用葡萄糖做出的结果稍有不同,初步判断①号菌为好氧菌,发酵型产酸,②号菌为好氧菌,氧化型产酸,但1号菌的产酸类型有待于进一步实验验证。
3.2过氧化氢酶测定
H2O2酶又称接触酶,能把H2O2分解为H2O和O2,O2变成气泡跑出来。
有气泡产生则为过氧化氢酶阳性实验,否则为阴性。
许多厌氧菌是阴性的。
实验材料:
菌种、移液枪、接种环、载玻片、3%H2O2溶液。
操作步骤:
取一环培养18~24h的菌苔涂在干净的载玻片上,然后滴一滴3%的H2O2。
结果:
将H2O2滴在两种菌上之后,都会产生气泡(①号菌上气泡产生剧烈,2号菌上气泡产生的缓慢)。
证明二者均为H2O2酶阳性。
3.3细胞色
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