OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测_精品文档.pdf
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中波紫外线(UV-B),其波长范围为280320nm,能够穿过大气层到达地球表面。
已知UV-B对植物具有双重效应,即在强度较高时1mol/(m2s)就作为逆境因子对植物造成伤害;而在较低强度下1mol/(m2s)却是一个信号调控因子参与植物的多种光形态建成1。
ROOTUV-BSENSITIVEs(RUSs)是近年来在拟南芥中发现的与极低强度UV-B信号传导有关的基因,它们的共同特点是具有一个功能未知的结构域DUF647,并通过该结构域互作2-3。
经生物信息学分析水稻基因组中也具有6个OsRUS基因,其中OsRUS1在水稻根和叶均有较强表达,但对这一信号传导途径涉及哪些基因,目前尚不清楚。
为了进一步查明这一信号通路的相关基因,拟采用酵母双杂交技术筛选与OsRUS1能够相互作用的蛋白。
OsRUS1开放阅读框(ORF)全长1782bp,结构域DUF647位于5231269bp,为了筛选与OsRUS1互作的基因以及初步确定参与互作的区域,构建了OsRUS1全长及不同区域片段的诱饵载热带作物学报2012,33
(1):
107-110ChineseJournalofTropicalCrops收稿日期:
2011-11-10修回日期:
2012-01-02基金项目:
国家自然科学基金“水稻OsRUS基因家族在UV-B信号传导中的功能研究”(No.30971709)。
作者简介:
潘家强(1985年),男,硕士研究生。
研究方向:
植物抗逆分子生物学。
*通讯作者:
侯学文,E-mail:
。
OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测潘家强1,侯学文1,2*1华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室,广东广州5106422华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室,广东广州510642摘要采用PCR技术扩增水稻(OryzasativaL)根UV-B敏感基因1(ROOTUV-BSENSITIVE1,RUS1)四个不同片段OsRUS1(1-1782)、OsRUS1(1-504)、OsRUS1(510-1282)、OsRUS1(1188-1782),连接到T载体pMD18-T-Simple上,测序无误后分别亚克隆到诱饵载体pGBKT7上,酶切和测序结果表明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体构建成功,读码框正确;转化重组载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD-Trp-DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明诱饵载体对酵母菌株Y187没有转录激活活性和毒害作用。
说明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白奠定了基础。
关键词水稻根对UVB敏感基因;诱饵载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测中图分类号Q782文献标识码AConstructionofOsRus1YeastTwo-HybridBaitVectorsandDetectionofTheirSelf-activatedActivityPANJiaqiang1,HOUXuewen1,21LabofMolecularPlantPhysiology,CollegeofLifeSciences,South-ChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China2KeyLaboratoryofPlantFunctionalGenomicsandBiotechnology,CollegeofLifeSciences,South-ChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,ChinaAbstractFourfragmentsofrice(OryzasativaL)ROOTUV-BSENSITIVE1(OsRUS1),OsRUS1(1-1782),OsRUS1(1-504),OsRUS1(510-1282),OsRUS1(1188-1782),wereamplifiedbyPCRfromclonedOsRUS1,andwereligatedwithpMD18-T-Simple,thentransformedtoE.coliTOP10competentcell.Thepositivecloneswereselectedandsequenced.TheconfirmedfragmentsweresubclonedtobaitvectorpGBKT7.ThefourconstructedpGBKT7baitvectorswerefurtherconfirmedbyenzymedigestionandsequencing.TheconfirmedpGBKT7baitvectorsweretransformedtoY187yeastcompetentcell.Theself-activationandtoxicityoftheplasmidstohostyeastY187byLacZandMEL1activityassaysandculturinginauxotrophmediumSD-Trp-DOResultsshowedthatthefourconstructedplasmidshadnoself-transcriptionalactivityandnottoxicitytoyeaststrainY187Thefourbaitvectorsconstructedcouldbeusedinyeasttwohybridsystem,whichlaidthefoundationforscreeninginteractionalproteinsofOsRUS1fromricecDNAlibraryKeywordsRiceROOTUV-BSENSITIVE1(OsRUS1);Baitvector;Yeasttwohybrid;Self-activatedtranscriptionalactivity;Toxicitydetectiondoi10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.022第33卷热带作物学报体,并进行这些载体对酵母转录活性的自激活活性及毒性检测,为下一步利用它们筛选水稻cDNA文库获得与OsRUS1互作的蛋白做好准备。
1材料与方法1.1材料酵母(Saccharomycescererisiae)Y187菌株,pGBKT7质粒,阳性对照质粒pGBKT7-53和pGADT7-T(美国Clontech公司),大肠杆菌TOP10菌株以及已克隆的OsRUS1基因pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS1cDNA-1782-MluI由本实验室保存;YNB和蛋白胨(Difco公司),SD-Trp-DO(美国Clontech公司),酵母提取物(OXOID公司),DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶(TaKaRa公司),KOD-Plus-NeoDNA聚合酶和dNTPs(TOYOBO公司),DS2000Marker(东盛生物公司),DNA胶回收试剂盒(普博欣生物公司),2XpowerTaqPCRMix(百泰克生物公司),X-gal(美国BBL公司),X-gal(美国GOLDBIO公司)。
本实验所用引物名称及序列:
OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F:
5-AGAATTCATGTCCTCCTCGCAATCTCTCC-3;OsRUS1cDNA-BamHI-504-R:
5-AGGATCCACCGGCCTTCTCCGCATC-3;OsRUS1cDNA-EcoRI-510-F:
5-AGAATTCGTGCCGAGCTGGCTGC-3;OsRUS1cDNA-BamHI-1282-R:
5-GGGATCCTCTTTGACTGAAGGAACTTGTCC-3;OsRUS1cDNA-EcoRI-1188-F:
5-AGAATTCCAATCGATTCAGCTGAGGACACT-3;OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R:
5-TGGATCCTTATGAAGGAGCATCTCCTATGC-3;T7sequencingprimer:
5-TAATACGACTCACTATAGGGC-3。
1.2方法1.2.1OsRUS1全长及片段克隆以本实验室已经克隆并测序的pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS1cDNA-1782-MluI为模板,分别以OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS1cDNA-BamHI-504-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-510-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1280-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-1188-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R为引物,采用高保真酶KOD-Plus-NeoDNA聚合酶反应体系,扩增获得OsRUS1cDNA的4个不同片段。
将这4个片段加A后与pMD18-T-Simple连接,转化E.coliTOP10感受态,筛选获得阳性克隆,并经测序确认无突变。
1.2.2诱饵载体的构建与鉴定将上述克隆并验证的pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHIMluI和pMD18-T-S-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI,以及空诱饵载体pGBKT7用EcoRI/BamHI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳检测酶切正确后,按常规分子生物学连接、转化、筛选,获得pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI4个诱饵载体,分别采用双酶切鉴定及测序确认读码框正确。
1.2.3诱饵载体转化酵母感受态及快速筛选按CLONTECH公司酵母双杂交手册4进行酵母菌株Y187感受态制备及转化。
对SD-Trp-DO营养缺陷板上的菌落进行快速PCR筛选。
方法如下:
挑取1个直径23mm转化酵母菌落于PCR管中,加入30L0.2SDS,漩涡振荡器上振荡15s,然后在PCR仪上90处理4min后,12000r/min离心1min,以上清液作为PCR反应模板。
按10LPCR反应体系加入0.2L提取液作为模板,引物采用对应的基因特异引物,采用PCRpremix进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4诱饵蛋白毒性检测4将上述验证保存的含诱饵载体的Y187分别划线于SD-Trp-DO营养缺陷板,倒置放30恒温箱培养34d至菌落长出后,挑1个较大的菌落(直径23mm)接种于50mLSD-Trp-DO液体培养基中(卡那霉素为20g/mL),30,250r/min过夜摇菌培养,第2天检测培养物的OD600。
1.2.5诱饵载体转录自激活活性的检测4取过夜摇菌培养的阳性菌株(含阳性互作质粒)、阴性菌株(含pGBKT7)以及上述4种转化酵母菌液2mL于离心管中,12000r/min离心
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