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dna扩增技术总结
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佚名发表于:
20XX-06-1520:
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PCR技术简史
一、PCR的最早设想
核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:
“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
二、PCR的实现
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
三、PCR的改进与完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,其缺点是:
①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。
此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次,仍需加入新酶。
1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有以下特点:
①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的XX%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的XX%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的XX%。
②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2.0Kb)。
由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由
变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
(一)模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
(二)模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
(三)引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
(Plateau)。
到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学
PCR反应体系与反应条件
一、标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10~100pmol
模板DNA0.1~2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
l/L
加双或三蒸水至100ul
二、PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
(一)引物
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
1、引物长度:
15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度:
以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
4、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
5、引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7、引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
(二)酶及其浓度
目前有两种TaqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
(三)dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),思想汇报专题就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
(四)模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原
体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
(五)Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
三、PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
(一)温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。
1、变性温度与时间
变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
2、退火(复性)温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的
篇二:
分子生物学技术总结
分子生物学技术总结
姓名:
梁潇班级:
2班学号:
1080800066
一、核酸/蛋白分离技术
1.DNA分离:
破碎细胞→抽提蛋白质→DNA沉淀→乙醇洗除盐→琼脂糖凝胶电泳检测用细胞裂解液裂解细胞膜,收集细胞核,加入SDS破裂核膜,用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来,经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质,无水乙醇沉淀DNA,XX%乙醇洗涤DNA沉淀,真空干燥后,溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。
2.RNA分离:
抑制RNase→抽提去蛋白质→DNase消化DNA→甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
3.蛋白分离:
(1)层析法
离子交换层析
亲和层析
(2)电泳分离:
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应。
它有两种形式:
非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
应用:
分离蛋白质和寡糖核苷酸
二、基因克隆技术
1.PCR:
在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应,PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
反应分为三步:
1)变性(92~95℃)2)退火3)延伸
PCR各步骤的目的
(1)预变性:
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
使DNA充分变性,减少DNA复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。
此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行。
(2)变性--退火--延伸循环:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
(3)PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟:
用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:
①延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。
(当然是在反应体系一定的条件下)②根据延伸速率推得,扩增1kb以内的DNA片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。
通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min,这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量③继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:
在用普通Taq酶进行PCR扩增时在
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