裂解液作用.docx
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裂解液作用
1、核酸抽提原理之袁州冬雪创作
简单地讲,核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步调.裂解是使样品中的核酸游离在裂崩溃系中的过程,纯化则是使核酸与裂崩溃系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质完全分离的过程.
经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等).盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境(如Tris),还包含抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸布局的稳定(如NaCl)等.去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜布局及解开与核酸相毗连的蛋白质,从而实现核酸游离在裂崩溃系中.裂崩溃系中还能够加入蛋白酶;操纵蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操纵以及获得更纯的核酸.也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)裂解的,该方法已经成为了RNA抽提的主流,却不是基因组DNA抽提的主流.
最常常使用的纯化方法,一是PC抽提+醇沉淀,二是介质纯化.第一种方法是操纵PC对裂崩溃系停止反复抽提以去除蛋白质,实现核酸与蛋白质的分离;再用醇将核酸沉淀下来,实现核酸与盐的分离.第二种方法则是操纵某些固项介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸,而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离.高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体,省略了PC操纵的费事.当然,也有不纯化的抽提方法,但是用途多局限于简单的PCR.其它杂质–如多糖、多酚等-的去除,基本上都是在这两种方法的基础上,通过增加一些特此外试剂,或者增加一些额外的步调来实现的.
2、懂得你的实验样品
如果你研究某个实验样品,而且要抽提它的核酸,以下的信息一定要先行收集:
该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量.如果你对样品的特点一无所知,当样品稍微有一点复杂时,抽提核酸的实验就会碰到许多问题.以血液为例,如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右,而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA,怎么能够成功?
失败了又怎么知道原因所在?
同时,只有对实验样品有所懂得,才干正确选择裂解方法.
绝大部分情况下,使用新鲜样品可以获得最好的成果.对一些杂质含量高的样品,如果使用新鲜样品抽提基因组DNA是碰到杂质残留过大的问题,可以试一下-20C保管一天后再抽提的对策,能够会有意想不到的效果.样品如果因为某些原因必须先行保管,也要先简化一下样品:
血液最好只保管有核细胞;将样品分割后保管,防止反复冻融.如果实验室不具有合适的保管条件,将样品先裂解后再保管,是一个不错的选择.
3、裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组DNA的首选.裂解包含膜蛋白的游离和与基因组DNA相毗连的蛋白质的游离.蛋白酶的作用是使蛋白质变小,故而对蛋白质的游离有宏大的促进作用;同时,宏大的基因组DNA是很容易“缠”住大分子的东西的,蛋白质被蛋白酶消化变小后,则不容易被基因组DNA“缠”住,有利于蛋白质在纯化操纵中的去除,使最终获得的基因组DNA的纯度更高.别的一个思路是,如果基因组DNA与蛋白质“缠”在一起,在纯化的过程中有两种能够:
如果基因组DNA的特性占优势,则纯化时以DNA的形式被保存下来,导致蛋白质的残留;如果蛋白质的特性占优势,则纯化时以蛋白质的形式被去除,导致DNA的损失.有些样品,如肌肉,即使是RNA抽提,也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液(或者在操纵中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质),原因在于这些样品中的蛋白质,是非常难以去除的.该方法是获得最大得率和最高纯度的基础.
不使用蛋白酶的去污剂裂解方法,仍然在细胞基因组DNA抽提方面有优势,尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操纵简单很重要时.节制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键.该方法连系高盐沉淀,可以实现最简单的操纵,但纯度及得率的稳定性能够会比用PC抽提的差一些.
高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法,是抽提RNA的首选.总RNA的抽提,最重要的是疾速裂解细胞膜,至于与基因组DNA相毗连的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化发生大的影响,可以不思索.高浓度蛋白质变性剂能疾速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的RNA酶,从而确保了RNA的完整性.除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物,其它绝大部分样品的RNA的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的.该方法也可用于基因组DNA抽提,非常疾速简单,但纯度不是很高.
含CTAB的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法.该方法成功与否与两个因素有关:
一是CTAB的质量,二是洗涤的完全程度.CTAB的质量对裂解效率有很大的影响,而且,似乎还说不清楚原因,因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB,批号分歧,效果便能够不同很大.洗涤去除CTAB要比其它的盐难一些,同时,CTAB的少量残留也会对酶活性有宏大影响,所以洗涤是否完全也是该方法成功与否的关键.裂解时的温度,多使用65C;但如果发现降戒严重或者得率太低,可以试一下37C–45C这个相对低温的区域.
SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有疾速、得率高、几乎无基因组DNA污染的特点.节制好裂解液/菌体的比例和操纵的温和是该方法成功的关键.蛋白质的沉淀效率在4℃会更好一些,所以,加入溶液III后在4℃静置一段时间以及采取4C离心去蛋白质,都可以提高质量.该方法纷歧定要使用PC纯化,但连系PC纯化,可以获得纯度很高的质粒.RNA的去除可以靠在溶液I中加入RNaseA(100ug/ml)或者在最后的溶解液中加入RNaseA(25ug/ml)来实现.总的感觉是,在溶液I中使用RNaseA,RNA的残留少一些.不过,经典沉淀几乎没有法子完全去除RNA残留.别的,对大质粒(50kb以上),该方法能够会有问题.
PCR模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法.该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,非常疾速.也正因为不纯化,所以,假阴性(即没有扩增出来的阳性)比例也比较高.该方法最简单的裂解液就是水,复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的PCR反应,而且能提高裂解效率,甚至还能够部分消除样品内抑制PCR反应杂质的东西,如TritonX-100、甲酰胺等.再复杂一点的就会含有诸如Chelex100之类的能吸附部分杂质的介质.操纵也非常简单,多使用温度的变更来实现样品的裂解,如煮沸、或者高温-低温的多次循环等.该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品,但却不适合用于断定某一个样品是阳性还是阴性.降低样品使用量可以提高阳性率,因为样品量的降低,同时意味着PCR的抑制物量的降低.
选择了合适的裂解液,下一步就是要节制好样品与裂解液的比例.这个问题非常重要,但却没有获得足够的重视.严肃的参考资料,都应该会提供一个简单的比例,如1ml裂解液可以用于Tmg组织或者C个细胞;我的建议是,你的样品量相对要小于资料所提供的.起始样品用多大,并没有详细的说法.如果不是样品量有限,则以能抽提出知足数次成功实验所需的核酸量,作为决议样品起始量的基础,会比较合理的.不要因为1ml裂解液可以抽提100mg样品,就一定使用100mg样品.裂解液的用量,概况上与抽提的成果(纯度及得率)没有关系,然而,在实际操纵中,对成果是有比较大的影响的.裂解液的用量原则是:
确保能完全裂解样品,同时使裂崩溃系中核酸的浓度适中.浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不完全,导致纯度下降.别的,裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的,而不是以核酸含量为基准,这一点务必服膺.
4、纯化方法评价
PC抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法.稳定、靠得住、经济、方便.PC抽提可以完全去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸.虽然每次PC抽提都会损失一部分核酸(因为不成能将水相全部移取),以及低浓度核酸的醇沉淀效率低,但这些问题都可以靠操纵的调整而得以处理或者减少影响.该方法的最大的问题是不适合大规模抽提.
PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段.苯酚能使蛋白质变性,变性后的蛋白质从水相中被析出,处于苯酚中或者苯酚/水相之间.PC抽提的关键是,一要混匀完全,二要用量足够.完全混匀,才干确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白质完全变性.许多人总是担心混匀的激烈程度是否会对核酸,尤其是基因组DNA造成破坏,实际上大可不必如此小心.激烈的混匀操纵,是会部分打断大分子的基因组DNA,但该破坏作用不会强烈到DNA变成10kb以内的小片段.手激烈晃动混匀后,基因组DNA的片段,大部分会大于20kb,这个大小,除了一些特此外要求外,对PCR和酶切,都是完全适用的.如果要求的片段非常大,如构建文库用,则不克不及使用激烈的混匀方法,而只能往返温和颠倒混匀–此时的关键是:
裂解液的比例要足够大,使体系不要太粘稠.用量要足够,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的.超出了该饱和度,裂崩溃系中的蛋白质不会被一次去除,必须靠多次抽提,方可完全去除.别的,体系太粘稠的坏处是,蛋白质难以完全去除,以及基因组DNA会断裂得更利害,所以要注意裂解液与样品的比例.4C离心操纵有利于更完全去除蛋白质.PC抽提的别的一个用途是,操纵酸性酚可以部分去除DNA的特点,在RNA抽提时获得DNA残留极少的RNA.不过有一点要提醒的是,有些植物样品,在去除某些杂质之前,是不克不及使用PC抽提的,否则核酸必定降解.
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法,同样也是一个非常不错的方法.与PC抽提方法相比,除了纯度的稳定性能够要低一点外,该方法几乎降服了PC抽提的所有缺点.更快、更轻松去除蛋白质所陪同的好处是,可以用于大规模抽提,缺乏是纯度(蛋白质残留)不敷稳定.蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些.
介质纯化方法,是一个越来越受到重视的方法.其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,而且因为受人为操纵因素影响小,纯度的稳定性很高(虽然纯度纷歧定比PC纯化方法更高).其致命弱点是样品过量.介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;别的一类则是颗粒状(如Glassmilk、磁性小珠等).颗粒状的介质的纯化操纵与经典的醇沉淀不同不大,都是通过数次的加液-倒液过程,干燥后,溶解即可获得纯化好的核酸.柱式纯化的操纵虽然也是有加液-倒液过程,但因为加入的液体通过离心后会进入别的一个离心管中,与含有核酸的柱子完全是分开的,所以洗涤更完全,操纵更省力(不必费心将核酸倒掉了,或者液体的残留).不过,介质纯化方法的成本是最高的.
5、醇的沉淀
醇的沉淀,目标是使核酸从裂崩溃系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质–主要是盐–的分离.实际操纵中,许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来,尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候.醇的沉淀其实不是非常特异性的,任何有机大分子及一些盐,当浓度达到一定水平后,都能够同步被沉淀下来.
就核酸而言,尺度的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量,但这决不是说这些盐是必不成少的或者醇的比例是不成更改的.实际操纵中不难发现,当裂崩溃系中核酸的浓度达到一定水平后,即使体系中不含教科书中建议的盐,单独使用醇也可使核酸沉淀下来;或者含有盐,使用低比例的醇也可使核酸沉淀下来(当然,得率能够
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