第四节DNA序列测定.docx
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第四节DNA序列测定
第四节DNA序列测定
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等(1977)提出的酶法(双脱氧链终止法)和Maxam(1977)提出的化学降解法。
尽管其原理截然不同,但这两种方式都一样生成彼此独立的假设干组带放射性标记的寡核苷酸,每组核苷酸都有一起的起点,却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列以某一特定核苷酸为结尾的长度各不相同的寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由那个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。
然后通太高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,经放射自显影后,从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础,可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。
DNA序列测定的简便方式为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础,时至今日,绝大多数蛋白质氨基酸序列都是依照基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外,自动化测序事实上已成为现今DNA序列分析的主流。
另外,新的测序方式亦在不断显现,如上世纪90年代提出的杂交测序法(sequencingbyhybridization,SBH)等。
一、双脱氧结尾终止法测序
㈠原理
双脱氧结尾终止法是Sanger等在加减法测序的基础上进展而来的。
其原理是:
利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,以单链DNA为模板,并以与模板事前结合的寡聚核苷酸为引物,依照碱基配对原那么将脱氧核苷三磷酸(dNTP)底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH结尾生成3′,5′-磷酸二酯键。
通过这种磷酸二酯键的不断形成,新的互补DNA得以从5′→3′延伸。
Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸(ddTNP)作为链终止剂。
ddTNP比一般的dNTP在3′位置缺少一个羟基(2′,3′-ddNTP)(图7-4-1),能够通过其5′三磷酸基团掺入到正在增加的DNA链中,但由于缺少3′-OH,不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。
因此,正在增加的DNA链再也不延伸,使这条链的延伸终止于那个异样的核苷酸处。
如此,在4组独立的酶反映体系中,在4种dNTP混合底物中别离加入4种ddNTP中的一种后,链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争,在掺入ddTNP的位置链延伸终止。
结果产生4组别离终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。
通太高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。
图7-4-1脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构
图7-4-2双脱氧链终止法测序原理
㈡模板
有两种类型的DNA模板能够作为Sanger法测序的模板,即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。
1.单链DNA模板在一样情形下,可将靶DNA片段克隆于M13mp载体,从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中分离取得的单链DNA模板。
这种单链模板成效最正确,只要细心把握模板与引物的最正确比例,有体会的测序人员通过一次结尾终止反映,能读取500个以上的核苷酸序列。
2.经热变性或碱变性的双链DNA模板尽管采纳变性双链DNA作测序模板显然简单且方便,但事实上很难取得单链模板那样的中意结果。
利用双链质粒模板测序,其中有两个相当重要的因素,即模板的质量和聚合酶的种类。
用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并非可取,高纯度的质粒最好采纳氯化铯-溴乙锭梯度平稳超速离心法制备。
第二是应采纳高质量的聚合酶。
一次结尾终止反映亦可能读出300核苷酸序列。
应该注意的是,适合做双链模板的质粒,最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志,有配套的通用引物结合区。
最经常使用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。
双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定,可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板进程。
㈢引物
酶法测序反映中都有一个与模板链特定序列互补的合成的寡核苷酸作为DNA合成的引物。
不管是将靶DNA片段克隆于M13mp载体获取的单链DNA作模板,仍是采纳变性双链DNA(如变性质粒DNA)模板,都有能够与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物(universalprimer)可用,而没必要另行设计与未知DNA序列互补的引物。
适合于M13mp系列载体的通用引物一样长15~29个核苷酸,固然这些引物也一样适用于那些克隆于pUC系列质粒的DNA进行双链测序。
这些测序用的通用质粒及其通用引物可直接从许多厂商购买到。
4DNA聚合酶
如前所述,选用适合的DNA聚合酶进行测序反映也是保证测序质量的重要因素之一。
经常使用于双脱氧结尾终止法测序的有几种不同的酶:
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段)此酶是最先用于成立Sanger测序的酶。
但通常会有两个问题:
①Klenow片段的持续合成能力较低,通常只能取得约250~350个核苷酸的序列,而且由于聚合酶随机从模板上解离而终止链延伸,通常会产生较高的本底和假带;②对同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域复制效能低下。
但此酶价钱廉价,对已知序列的亚克隆进行鉴定仍有应用价值。
2.测序酶(sequenase)该酶是一种通过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,其原先很强的3′→5′外切酶活性,经化学修饰后大部份被排除。
目前经常使用的测序酶多数是基因工程产品,完全缺失3′→5′外切酶活性,具有活性超级稳固靠得住、持续合成能力强和聚合速度高等优势,是测定较长DNA的首选酶。
市售的各类以该酶为基础的测序试剂盒,成效甚佳。
3.耐热DNA聚合酶PCR技术的应用正在不断扩大,耐热DNA聚合酶应用于以Sanger双脱氧链终止法为基础的DNA测序方案,已进展成为被称为“循环测序”或“线性扩增测序”方式。
在该类测序方式中,由于利用了耐热DNA聚合酶,与其他DNA聚合酶相较较具有二大优势。
其一,由于采纳热循环方式线性扩增模板DNA,取得清楚可辨的序列梯带所需要的模板DNA量少;其二,由于,耐热DNA聚合酶可在95℃高温下维持稳固,测序反映能够在高温(70~80℃)下进行。
因此能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的阻碍。
因此,循环法能够方便地对PCR产物、质粒DNA、λDNA和粘粒DNA等双链模板进行序列测定,专门有利于对高GC碱基含量的模板测序。
循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。
循环测序反映与一般PCR反映有所不同。
只需一条引物,通过单引物进行热循环,模板DNA以线性方式被扩增,而不是标准PCR的指数方式扩增;反映底物除四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)外,还加入了双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),进行扩增时,链的延伸终止于掺入ddNTP的位置,产生别离终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。
㈤放射性标记
传统的DNA测序方式都采纳α-32P-dNTP作为放射性标记物,但由于32P发射的高能β射线,常会引发二个问题。
第一是致使放射自显影图谱条带扩散、分辨率低,限制了识读序列的数量和准确性。
第二是32P衰变会致使DNA样品分解,通常都应在测序反映后24h内进行电泳,不然无法取得好的结果。
最近几年来α-35S-dNTP被普遍采纳,是由于35S产生较弱的β射线,克服了32P的二大缺点。
放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底,测序反映产物可在-20℃保留一周,而分辨率并非下降。
㈥关于DNA序列的识读
DNA序列的识读是一个熟能生巧的进程。
注意几点技术:
①在显影前后必然要注意标明模板名称、日期和测序人等,并标明各套反映位置;②识读时从显而易见的特点序列开始,如持续的同聚核苷酸(如TTTTT、AAAAA)或交替显现的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到这种序列,即可较快地确信目的序列的位置。
二、Maxam-Gilbert化学降解法测序
几乎在双脱氧法进展的同时,1977年Maxam-Gilbert等提出了化学降解法。
自Maxam-Gilbert第一次提出以来,其实验方案大体上没有转变。
㈠原理
化学降解法与包括合成反映的链终止法不同,需要对原DNA进行化学降解。
其大体原理是,第一对待测DNA结尾进行放射性标记,再通过5组(也能够是4组)彼此独立的化学反映别离取得部份降解产物,其中每一组反映特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。
因此,产生5组(或4组)不同长度的放射性标记的DNA片段,每组中的每一个片段都有放射性标记的一起起点,但长度取决于该组反映针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。
尔后各组反映物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,通过放射自显影检测结尾标记的分子,并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。
测序原理如图7-4-3所示。
图7-4-3化学裂解法测序原理
㈡待测DNA的结尾标记
化学降解法测序第一要制备单侧结尾标记的待测DNA片段。
DNA片段的核素标记有三种方式:
1.利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5ˊ-结尾关于去5′-磷酸化的DNA片段,T4噬菌体多核苷酸激酶能够通过正向反映将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5ˊ-结尾;关于5′-磷酸化的DNA片段,在过量ATP条件下,该酶能够通过互换反映将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5ˊ-结尾磷酸基发生互换反映而标记。
但关于双链DNA片段,由于DNA的双侧均被标记,不能直接用于测序反映。
需要经限制性内切酶切割,电泳分离二种不同大小的标记片段,或直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链,但这种分离方式比较困难,较少利用。
2.利用结尾转移酶和α-32P-ddNTP标记DNA的3ˊ-结尾在二价阳离子存在下,结尾转移酶催化dNTP加入DNA分子的3ˊ-羟基结尾,若是作为底物的核苷酸通过修饰(如ddNTP),那么能够在DNA的3ˊ-OH上仅加入一个核苷酸。
关于双链DNA片段,亦存在DNA的双侧均被标记问题,可通过上述一样的方式分离。
图7-4-4对双链DNA进行不对称标记的经常使用方式
3.利用Klenow片段和α-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3ˊ-凹进结尾进行标记这种方式能直接制备单侧结尾标记的DNA,但要求待测DNA能知足以下条件之一:
①DNA两头的一侧为3ˊ-凹进结尾,而另一侧为平端或3ˊ-凸出结尾;②两头虽均为3ˊ-凹进结尾但结尾单链结构不同,这时可选择不同的γ-32P-NTP来实现结尾标记。
这是对双链DNA进行不对称标记的经常使用方式,如图7-4-4所示。
CS载体系列(CS是chemicalsequecing的缩写)是专门为化学降解法测序进行结尾标记而构建的一类克隆载体,如pSP64CS和pSP65CS。
这种载体最重要的特点是,在待测DNA克隆片段的周围有两个可被限制性酶Tth111识别的典型位点(GACN↓NNGTC,不对称),能在克隆DNA片段双侧不同的3ˊ-凹进结尾,从而方便地实现对待测DNA的单侧标记。
值得专门注意的是,化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求,因为盐浓度会干扰肼对胸腺嘧啶的修饰,也会抑制A+G反映中的去嘌呤进程。
因此,标记的DNA一样要经酚/氯仿抽提、70%乙醇洗涤除盐,并用去离子水溶解而不用TE缓冲液。
㈢碱基特异的化学切割反映
在化学降解法中,专门用来对核苷酸作化学修饰并打开碱基环的化学试剂要紧有肼(hydrazine)和二硫酸甲酯(dimethylsulphate)。
肼又叫联氨(NH2-NH2),在碱性条件下,能作用于T/C的C4和/或C6原子位置,并同C4-C5-C6环化形成一种新的五元环。
肼进一步作用释放出吡唑啉酮环。
在六氢吡啶的作用下,通过β排除反映,该碱基两头的磷酸基团便会以磷酸分子形
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