PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌-O157-H7特异性和灵敏性的比较.ppt

PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌-O157-H7特异性和灵敏性的比较.ppt

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PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌O157:

H7特异性和灵敏性的比较,湖北检验检疫局技术中心赵晖,论文撰写背景：

本论文的研究内容是在澳大利亚伊丽莎白麦克阿瑟农业研究所访问研究期间所做实验的一部分。

国外一直很重视对O157:

H7的研究工作，完成论文时，刚好FDA公布了O157:

H7的暴发事件。

这篇论文是专门为这次征文活动而写的，希望能完善和建立最适合检验检疫运用的O157:

H7快速检验方法。

简介,本文中采用的是普通PCR检测方法，因为目前普通PCR已经是一种简单而经济的方法，在国外被广泛采用，趋于成熟和稳定，我们将这种方法用于日常检测应该是可行的。

本文所用的3种检测目的基因和4种致病基因是从众多的文献中筛选出来的。

实验目的,通过对PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌O157:

H7特异性和灵敏性的比较，以选择一种用于样品中O157:

H7检测的最佳方法。

实验方法,用单一PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测O157:

H7和非O157:

H7菌株31株，比较检测的特异性。

用纯化的O157:

H7基因组DNA以及从1.71071.7个O157:

H7细菌中提取的DNA为模板这两种方法比较分别扩增三种基因检测的灵敏度。

菌株,本试验所用菌株均为澳大利亚伊丽莎白麦克阿瑟农业研究所（ElizabethMacarthurAgriculturalInstitute）免疫微生物实验室保存菌株（表1），所有大肠杆菌血清型均经墨尔本大学微生物系鉴定。

试验菌株分别接种于Luria-Bertani（LB）肉汤中，37，200rpm振荡培养过夜（1216h）。

细菌DNA模板制备,快速加热法：

用InstaGeneMatrix试剂盒（BIO-RAD,澳大利亚）制备DNA模板。

纯化的DNA模板：

用Promega的DNA纯化试剂盒（Promega,澳大利亚）制备纯化DNA。

试验用引物,PCR反应,扩增rfbE和fliCH7基因的反应程序.扩增uidA基因的反应程序.,致病基因的检测,所有大肠杆菌菌株均采用AdrienneW.Paton和JamesC.Paton的多重PCR方法检测4种大肠杆菌致病基因：

stx1、stx2、eaeA和ehxA3。

PCR检测的特异性,以包括O157:

H7等血清型的18株大肠杆菌和13株非大肠杆菌的DNA为模板（快速加热法制备），以PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因用于PCR特异性检测。

PCR检测的灵敏度,采用两种方法测定

（1）用纯化的O157:

H7的DNA为模板。

（2）用快速加热法分别提取梯度稀释的O157:

H7菌悬液的DNA作为模板，同时对每个稀释梯度中的O157:

H7进行平板菌落计数。

实验结果,特异性的比较结果：

所有大肠杆菌O157菌株扩增出了rfbE基因；O157:

H7、H、H1、HN、O75:

H7和H都扩增出了fliCH7基因；O157:

H7、H、H1和HN均扩增出uidA基因；其他菌株都没有扩增产物。

灵敏度的比较结果：

（1）扩增三种基因的检测灵敏度均为10pg纯化基因组DNA，

（2）扩增uidA和rfbE基因，PCR检测的灵敏度均为1.7102个细菌；扩增fliCH7基因，PCR检测的灵敏度为1.7101个细菌。

表1特异性试验菌株及其携带的致病基因以及目的基因PCR扩增结果,讨论,针对O157:

H7的rfbE基因设计的引物均有很高的特异性。

fliCH7基因对检测O157:

H7有辅助鉴定作用，但在直接对样品进行快速检测时，用rfbE和fliCH7基因同时检测O157:

H7似乎没有意义，此方法更适用于已经分离纯化菌株的鉴定。

多种大肠杆菌均携带4种致病基因，因此用致病基因作为目的基因的多重PCR检测方法只适用于纯化菌株的致病分析，而将它们直接用于对样品的检测是不可靠的。

讨论,一般待测样品中的菌相复杂，同时存在多种细菌，用多重PCR直接对样品中的O157:

H7进行检测鉴定，容易出现不正确的结果。

按常规检测O157:

H7的方法，O157:

H就会漏检，用PCR方法结合血清学和生化鉴定方法将可以解决这些问题。

用PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测O157:

H7，都必须结合血清学等鉴定方法才能区别H7、H、H1和HN等血清型。

对于细菌含量较少或污染不严重的样品建议进行增菌培养以提高检出率。

结论,以特异性强的rfbE为目的基因,先用单一PCR筛选已增菌样品中的大肠杆菌O157，再结合血清学、多重PCR等方法对O157分离株鉴定分型，可快速准确地检测鉴定O157:

H7等血清型。