第三章生物制品的菌种与毒种资料.ppt
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生物制品的菌种与毒种第二章主要内容:
主要内容:
一、菌种、毒种的概念与分类一、菌种、毒种的概念与分类二、菌种、毒种的一般要求二、菌种、毒种的一般要求三、菌种、毒种的选育三、菌种、毒种的选育一、生物制品菌种和毒种的概念与分类一、生物制品菌种和毒种的概念与分类(一一)概念概念凡凡应应用用于于生生物物制制品品(疫疫苗苗、免免疫疫血血清清及及诊诊断断制制剂剂等等)生生产产、检检定定和和研研究究的的细细菌菌、病病毒毒的的原原种种,以以及及分分类类地地位位上上在在原原虫虫以以下下的的生生物物种种均均属属生生物物制制品品的的菌菌种种与与毒毒种种范范围围。
其其中中主主要要指指生生物物制制品品生生产产,检检定定用用的的菌菌种种与与毒毒种种。
有有人人建建议议,将将制制苗苗用用的的细细胞胞株株(二二倍倍体体细细胞胞株株、传传代细胞系等代细胞系等)纳入菌种与毒种的管理范围。
纳入菌种与毒种的管理范围。
菌菌(毒毒)种种是是国国家家的的重重要要生生物物资资源源,现现在在世世界界各各国国对对这这项项资资源源都都极极为为重重视视,并并设设置置各各种种专专业业性性的的保保藏藏机机构构,现现在在不不少少国国家家的的菌菌种种与与毒毒种种中中心心都都用用电电子子计计算算机机进进行行管管理理,在在欧欧洲洲甚甚主主准准备备对对国国家问的菌种中心用电子计算机联网。
家问的菌种中心用电子计算机联网。
(二二)菌、毒种的分类菌、毒种的分类生生物物制制品品用用的的菌菌种种和和毒毒种种,按按其其在在生生物物制制品品生生产产、检检定定过程中用途的不同,可分为四类:
过程中用途的不同,可分为四类:
1.1.生产用的菌种和毒种生产用的菌种和毒种2.2.工具菌种和毒种工具菌种和毒种3.3.检定用的菌种和毒种检定用的菌种和毒种4.4.标准菌株标准菌株/毒株以及参考菌株毒株以及参考菌株/毒株毒株直接生产用的菌和毒种直接生产用的菌和毒种免疫用的菌和毒种免疫用的菌和毒种加工用的菌和毒种加工用的菌和毒种二、生物制品菌种和毒种的一般要求二、生物制品菌种和毒种的一般要求菌菌种种和和毒毒种种是是生生物物制制品品质质量量的的关关键键因因素素之之一一。
制制备备疫疫苗苗、免免疫疫血血清清必须安全、有效;诊断制剂必须特异而敏感。
必须安全、有效;诊断制剂必须特异而敏感。
(一一)来源来源(历史历史)清楚,资料完整清楚,资料完整由由专专门门机机关关保保管管、分分发发的的生生物物制制品品用用菌菌种种和和毒毒种种,对对其其来来源源、分分离离和和传传代代的的历历史史、生生物物学学特特性性以以及及免免疫疫学学特特性性、安安全全与与效效力力检检定定等等资资料料,有有关审批单位的鉴定,结论及审核批示材料均应清楚。
关审批单位的鉴定,结论及审核批示材料均应清楚。
兽兽医医生生物物制制品品制制造造规规程程规规定定,凡凡经经农农业业部部发发给给批批准准文文号号的的产产品品,生产所需的菌种和毒种,由中监所或中监所委托分管的单位负责供应。
生产所需的菌种和毒种,由中监所或中监所委托分管的单位负责供应。
我我国国兽兽医医生生物物制制品品菌菌种种和和毒毒种种管管理理33种种情情况况:
中中国国兽兽药药监监察察所所(中中监监所所)鉴鉴定定和和保保管管;委委托托有有关关单单位位代代管管,如如委委托托哈哈尔尔滨滨兽兽医医研研究究所所管管理理的的猪猪丹丹毒毒GCGC4242菌菌苗苗株株、黑黑龙龙江江省省生生物物制制品品一一厂厂代代管管的的禽禽霍霍乱乱G190E140G190E140菌菌苗苗株株等等;各各地地菌菌种种,由由中中监所统一鉴定,如大肠杆菌。
监所统一鉴定,如大肠杆菌。
(二二)生物学特性比较典型生物学特性比较典型生生物物学学特特性性包包括括菌菌种种和和毒毒的的形形态态特特征征、培培养养特特性性(菌菌落落特特征征、蚀蚀斑斑特特征征):
对对动动物物的的病病原原性性特特点点及及引引起起细细胞胞病病变变的的特特征征;生生物物化化学学、免免疫疫学学及及血清学特性等等,均应符合标准。
血清学特性等等,均应符合标准。
制制造造灭灭活活苗苗的的菌菌种种和和毒毒株株,应应该该是是标标准准强强毒毒或或者者弱弱毒毒,以以免免疫疫原原性性优优良良为为基基本本条条件件,必必须须经经过过严严格格的的审审查查与与鉴鉴定定,要要求求一一切切性性状状必必须须典典型型。
如如规规程程规规定定,制制造造猪猪丹丹毒毒灭灭活活苗苗,必必须须选选择择典典型型光光滑滑型型、圆圆形形、露露珠珠状状的的小小菌菌落落。
制制造造弱弱毒毒苗苗的的毒毒种种与与菌菌种种,毒毒力力必必须须稳稳定定,形形态态特特征征典典型型,不不易易变变异异,特特别别应应注注意意其其与与强强毒毒株生物学性状区别的要点。
株生物学性状区别的要点。
生生物物制制品品主主要要是是用用于于预预防防、治治疗疗和和诊诊断断畜畜禽禽等等传传染染性性疾疾病病的的免免疫疫制制剂剂,因因此此要求生物制品生产用的菌种和毒种必须具有良好的抗原性和免疫原性。
要求生物制品生产用的菌种和毒种必须具有良好的抗原性和免疫原性。
对对制制备备活活疫疫苗苗的的菌菌种种和和毒毒种种,必必须须严严格格筛筛选选、严严格格检检验验。
特特别别应应注注意意其其安安全全性,包括菌种和毒种本身及外源性污染两个方面。
性,包括菌种和毒种本身及外源性污染两个方面。
(三三)血清型相符血清型相符在在菌菌种种和和毒毒种种选选择择与与鉴鉴定定时时,需需特特别别注注意意菌菌种种和和毒毒种种特特性性与与血血清清型型与疫苗使用地区流行的病原相符。
与疫苗使用地区流行的病原相符。
(四四)遗传性状稳定遗传性状稳定菌菌种种和和毒毒种种在在保保存存、传传代代和和使使用用过过程程中中,受受各各种种因因素素影影响响而而变变异异,因此保证其遗传性状稳定是保证生物制品质量的重要因素之一。
因此保证其遗传性状稳定是保证生物制品质量的重要因素之一。
微微生生物物种种是是以以群群体体形形式式存存在在,遗遗传传学学纯纯一一性性和和相相对对稳稳定定性性是是指指群群体体变变异异幅幅度度必必须须有有严严格格的的限限制制。
为为保保持持种种的的纯纯一一和和相相对对稳稳定定,生生产产生生物物制制品品的的菌菌、毒毒种种应应通通过定期传代、筛选、检定等工作进行控制。
过定期传代、筛选、检定等工作进行控制。
生生产产用用的的病病毒毒毒毒种种是是否否具具有有同同质质性性,直直接接关关系系到到生生物物制制品品的的质质量量。
我我国国用用于于生生产产畜畜禽禽用用活活疫疫苗苗的的病病毒毒毒毒种种,一一类类是是我我国国自自行行分分离离培培育育的的弱弱毒毒株株;另另一一类类是是从从国国外外引引进进的的。
二二者者大大部部分分都都未未进进行行过过纯纯化化和和标标准准化化,均均属属于于群群体体(多多克克隆隆)病病毒毒,病毒粒于的大小与构造、增殖速度、蚀斑形成能力。
病毒粒于的大小与构造、增殖速度、蚀斑形成能力。
三、菌种和毒种选育三、菌种和毒种选育(一一)强毒力菌种和毒种选育强毒力菌种和毒种选育强强毒毒菌菌种种和和毒毒种种广广泛泛用用于于诊诊断断制制品品、抗抗病病血血清清、灭灭活活疫疫苗苗和和疫疫苗苗制制品品的的效效力力检检验验。
用用作作人人工工培培育育弱弱毒毒的的原原始始毒毒种种,并并用用于于微微生生物物学学、免免疫疫学及传染病学等研究。
学及传染病学等研究。
强强毒毒菌菌种种和和毒毒种种常常自自疾疾病病流流行行地地区区的的典典型型患患病病动动物物体体内内分分离离。
在在疾疾病病流流行行初初期期,从从临临床床症症状状和和病病理理变变化化典典型型而而又又未未经经任任何何治治疗疗的的患患病病动动物物体体分分离离到到毒毒力力强强和和抗抗原原性性良良好好的的自自然然强强菌菌株株和和毒毒株株,如如我我国国的的石石门门系系猪猪瘟瘟病病毒毒和和多多杀杀性性巴巴氏氏杆杆菌菌C44-1C44-1等等。
然然后后,用用从从各各地地分分离离的的自自然然强强菌菌株株和和毒株中筛选出符合标准的菌株和毒株,供生物制品的制造和检验。
毒株中筛选出符合标准的菌株和毒株,供生物制品的制造和检验。
病毒或细菌分离病毒或细菌分离鸡胚鸡胚冻干、冷冻或冷藏保存冻干、冷冻或冷藏保存筛选出毒力强,生长稳定、纯净的毒株,用于制备疫苗、诊断液筛选出毒力强,生长稳定、纯净的毒株,用于制备疫苗、诊断液和治疗用抗体活用于疫苗效力检验等和治疗用抗体活用于疫苗效力检验等稳定性试验稳定性试验抗原性试验抗原性试验致病力试验致病力试验纯粹性试验纯粹性试验原动物原动物抗原性抗原性细胞细胞LD50ELD50免疫原性免疫原性实验实验动物动物EID50攻毒保护攻毒保护试验试验血清学血清学试验试验TICD50(一一)强强毒毒力力菌菌种种和和毒毒种种选选育育11毒力鉴定毒力鉴定常常用用易易感感实实验验动动物物、本本动动物物、鸡鸡胚胚或或易易感感细细胞胞测测定定分分离离菌菌株株和和毒毒株株MLD(MLD(最最小小致致死死量量)、LDLD5050(半半数数致致死死量量)、CELDCELD5050(鸡鸡胚胚半半数数致致死死量量)、CEIDCEID5050(鸡胚半数感染量鸡胚半数感染量)或或TCIDTCID5050(细胞半数感染量细胞半数感染量)22免疫原性测定免疫原性测定菌菌株株和和毒毒株株的的抗抗原原性性包包括括:
抗抗原原与与抗抗体体结结合合发发生生特特异异性性反反应应的的反反应应原原性性和和刺刺激激机机体体产产生生抗抗体体及及致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞的的免免疫疫原原性性。
反反应应原原性性多多采采用用血血清清学学方方法法测测定定,以以抗抗体体滴滴度度或或效效价价表表示示;免免疫疫原原性性多多采采用用对对免免疫疫动动物物用用定定量量原原强强毒毒菌菌株株和和毒毒株株攻攻击击测测定定保保护护效效力力。
无无论论致致病病力力测测定定或抗原测定,均应设阴阳性对照,否则无效。
或抗原测定,均应设阴阳性对照,否则无效。
33稳定性测定稳定性测定对对适适应应于于培培养养基基、鸡鸡胚胚或或易易感感细细胞胞上上增增值值培培养养和和传传代代的的菌菌株株或或毒毒株株的的毒毒力力(致致病病力力)和和抗抗原原性性还还要要进进行行稳稳定定性性测测定定,以以证证明明其其后后代代特特性不变,才有使用价值,并参与筛选择优。
性不变,才有使用价值,并参与筛选择优。
44综合判定,冻干保存综合判定,冻干保存根根据据致致病病力力、抗抗原原性性和和稳稳定定性性测测定定结结果果,筛筛选选出出毒毒力力强强、形形状状稳稳定定的的菌菌株株或或毒毒株株,经经增增值值后后进进行行冻冻干干保保存存。
冻冻干干后后菌菌种种于于4C4C保保存存,冻冻干干的的病病毒毒种种保保存存于于-20-20以以下下,可可保保存存多多年年。
通通常常经经鉴鉴定定的的菌菌株株或或毒毒种种批批,按按需需分分装装后后冻冻干干保保存存,可可使使用用多多年年。
冻冻干干菌菌株株或或毒毒种种一一经经动动物传代,即应重新分离、鉴定和检测后方能供种子或种毒用。
物传代,即应重新分离、鉴定和检测后方能供种子或种毒用。
(二二)弱毒菌种和毒种的选育弱毒菌种和毒种的选育用用途途:
弱毒菌种和毒种主要用于弱毒活疫苗、部分诊断制品以及抗血清的制造。
特特性性:
致病力极微弱或无致病力,免疫原性优良,能使免疫动物获得坚强的免疫力。
来来源源:
从自然界筛选,或以人工改变野生型强毒株的遗传特性进行培育获得。
无论自然弱毒株或人工培育弱毒株,均是由微生物基因核苷酸碱基的改变,而导致遗传性状突变及毒力降低的结果。
1.1.弱毒菌种和毒种弱毒菌种和毒种弱毒菌(毒)种的选育弱毒菌(毒)种的选育化学途径化学途径人工诱变致弱人工诱变致弱同源动物同源动物(如如NDVLaSota株株)自然弱毒株的分离自然弱毒株的分离异源动物异源动物(如如HVTFC126株株)物理途径物理途径生物途径生物途径亚硝基胍亚硝基胍醋酸铊醋酸铊洗衣粉洗衣粉高温高温紫外线紫外线非易感动物非易感动物鸡胚、细胞鸡胚、细胞杂交减毒杂交减毒2.2.弱毒菌种和毒种的选育途径弱毒菌种和毒种的选育途径1.1.自然弱毒株的选育自然弱毒株的选育自然弱毒株又称自发突变毒株,由自然强毒株在自然因素作用下因遗传基因突变形成了与祖代性状(特别是致病力和抗原性)不尽相同的生物株。
这些自然因素,如异种非易感动物、温度、日光、干燥、紫外线等都可能是导致细菌和病毒自发突变的原因。
因此,人们往往有意或无意地从自然中分离、筛选和育成一些弱毒菌(毒)株,作为兽医生物制品的种毒。
例例如如,鸡鸡新新城城疫疫出出LaSotaLaSota弱弱毒毒株株和和D10D10,是是分分别别从从自自然然鸡鸡群群和和鸭鸭群群中中分分离离到到的的,然然后后再再通通过过克克隆隆、挑挑选选等等途途径径育育成成。
鸡鸡马马立立克克氏氏病病火火鸡鸡疱疱疹疹病病毒毒FC126FC126株株即即分分离离于于火火鸡鸡,对对鸡鸡无无致致病病性性,其其抗抗原原性性与与鸡鸡马马立立克克氏氏病病病病毒毒一一致致。
然然而而,微微生生物物自自发发突突变变率率往往往往很很低低,形形成成具具有有稳稳定定遗遗传传性性状状的的过过程程比比较较长长,因因此此获获得得的的机率不高。
机率不高。
2.2.经典方法诱发突变弱毒株的选育经典方法诱发突变弱毒株的选育原理和方法:
原理和方法:
某些化学药物可引起微生物基因核苷酸碱基发生改变,从而使该微生物遗传性状产生变化,这类物质为诱变剂。
物理因素也能引起微生物突变,使其代谢类型发生变化,从而获得遗传性状不同于祖代的毒株。
异种非易感动物能使强迫进入的微生物经传代诱变、适应而发生遗传性状不同于祖代的突变,也能育成弱毒株。
此外,也可通过细胞或禽胚等传代发生突变而育成弱毒株。
以上这些途径,既可单独使用,也可交叉联合使用。
以上这些途径,既可单独使用,也可交叉联合使用。
(1)
(1)通过化学途径选通过化学途径选微微生生物物在在体体外外培培养养传传代代过过程程中中,经经诱诱变变剂剂处处理理,可可极极大大地地提提高高其其基基因因突突变变率率,从从而而获获得得弱弱毒毒菌菌株株或或毒毒株株。
例例如如,用用亚亚硝硝酸酸基基胍胍处处理理支支原原体体育育成成了了鸡鸡支支原原体体疫疫苗苗株株;猪猪副副伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌强强毒毒株株则则在在含含有有1/5001/5001/40001/4000醋醋酸酸铊铊的的肉肉汤汤培培养养基中培养传代基中培养传代5050代次,培育成弱毒株用于制造疫苗。
代次,培育成弱毒株用于制造疫苗。
(2)
(2)通过物理途径选育通过物理途径选育热热和和干干燥燥等等物物理理因因素素可可干干扰扰DNADNA的的复复制制,从从而而引引起起突突变变,导导致致遗遗传传性性状状的的改改变变。
18811881年年巴巴斯斯德德将将炭炭疽疽强强毒毒菌菌株株在在42.542.5高高温温下下长长期期传传代代培培养养,导导致致了了遗遗传传性性状状变变异异,从从而而育育成成了了炭炭疽疽弱弱毒毒菌菌株株作作为为制制造造用用菌菌种种;18851885年年又又将将含含有有狂狂犬犬病病病病毒毒的的脑脑脊脊髓髓置置于于干干燥燥条条件件中中处处理理,制制成成弱弱毒毒疫疫苗苗。
日日本本乙乙型型脑脑炎炎病病毒毒强强毒毒株株则则经经紫紫外外线线照照射射后后引引起起突突变变,从从而而出出现现遗遗传传性性状状分分离离,再再进进行行蚀蚀斑斑挑挑选选,育育成成了弱毒株。
了弱毒株。
(3)(3)通过生物途径选育通过生物途径选育通通过过生生物物途途径径育育成成的的弱弱毒毒株株,其其生生物物稳稳定定性性极极佳佳,但但育育成成过过程程比比较较长长。
迄迄今今为止,大部分活疫苗的菌种和毒种是由该途径选育而成。
常用育成路线有为止,大部分活疫苗的菌种和毒种是由该途径选育而成。
常用育成路线有:
1)1)适应非易感动物适应非易感动物(非自然宿主非自然宿主)通通常常用用兔兔、小小鼠鼠、地地鼠鼠、豚豚鼠鼠、鸡鸡等等实实验验动动物物,其其优优点点是是动动物物来来源源广广、饲饲养养管管理理方方便便、成成本本低低及及操操作作简简便便。
多多采采取取大大剂剂量量腹腹腔腔、静静脉脉或或脑脑内内接接种种。
如如我我国国的的猪猪瘟瘟兔兔化化弱弱毒毒株株,是是将将猪猪瘟瘟病病毒毒强强毒毒株株通通过过兔兔体体传传400400余余代代后后育育成成的的;鸭鸭瘟瘟鸡胚化弱毒株则是将强毒株通过鸭胚鸡胚化弱毒株则是将强毒株通过鸭胚99代和鸡胚代和鸡胚2323代后培育而成。
代后培育而成。
2)2)适应细胞适应细胞通通常常多多采采用用同同源源或或异异源源动动物物组组织织的的原原代代细细胞胞,或或者者是是一一种种细细胞胞,或或者者用用22种种细细胞胞。
日日本本育育成成的的猪猪瘟瘟GPEGPE弱弱毒毒株株是是将将猪猪瘟瘟ALDALD强强毒毒株株通通过过猪猪睾睾丸丸细细胞胞142142代代和和牛牛睾睾丸丸细细胞胞3636代代后后,再再在在豚豚鼠鼠肾肾细细胞胞传传4141代代后后育育成成的的。
我我国国的的马马传传染染性性贫贫血血驴驴白白细胞弱毒株,是将马传贫驴强毒株通过驴白细胞传代育成的。
细胞弱毒株,是将马传贫驴强毒株通过驴白细胞传代育成的。
3)3)杂交减毒杂交减毒将将两两种种遗遗传传性性状状不不同同的的菌菌株株或或毒毒株株,在在传传代代培培育育中中进进行行自自然然杂杂交交,以以导导致致不不同同菌菌株株或或毒毒株株间间基基因因发发生生交交换换而而育育成成有有使使用用价价值值的的弱弱毒毒株株。
如如流流行行性性感感冒冒弱弱毒毒株株的的育育成成,是是将将温温度度敏敏感感弱弱毒毒株株(抗抗原原性性较较低低)与与流流行行强强毒毒株株进进行行混混合合培培养养传传代代,便便两两者者毒毒力力基基因因发发生生交交换换,其其后后代代即即成成为为毒毒力力低低和和抗抗原原性性强强的的毒毒株株,再再用用于于制制造造弱弱毒疫苗。
毒疫苗。
由由于于微微生生物物变变异异的的方方向向难难以以预预测测,所所以以只只能能在在培培育育过过程程中中对对各各个个表表现现遗遗传传性性状状的的群群体体按按照照需需要要进进行行选选择择,以以求求筛筛选选出出目目的的变变异异株株。
这这种种选选择择首首先先从从外外表表观察和检查开始;然后再作系统的检测筛选。
观察和检查开始;然后再作系统的检测筛选。
初初选选依依据据包包括括:
细细菌菌菌菌落落特特征征变变异异,如如菌菌落落大大小小、形形状状,色色泽泽、粗粗糙糙或或光光滑滑称称荧荧光光等等;病病毒毒蚀蚀斑斑的的变变异异;对对温温度度敏敏感感性性变变异异;对对药药物物敏敏感感性性变变异异;对对营营养养要要求求变变异异,如如对对氨氨基基酸酸的的特特殊殊需需要要;对对宿宿主主动动物物易易感感性性变变异异。
我我国国经经过过长长期期研研究究,育育成成了了一一些些弱弱毒毒株株作作为为疫疫苗苗种种毒毒生生产产疫疫苗苗,在在控控制制和和消消灭灭动物疫病中发挥了重要作用。
动物疫病中发挥了重要作用。
表表3-1我国一些弱毒株的育成线路与方法我国一些弱毒株的育成线路与方法弱弱毒毒株株致致弱弱线线路路与与方方法法猪丹毒弱毒菌株(GC42)强毒株豚鼠370代鸡42代猪丹毒弱毒菌株(G4T10)强毒株豚鼠370代含有0.01%0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代猪肺疫弱毒菌株(EO630)强毒株含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代马流产弱毒菌株(C355)强毒株含醋酸钝培养基传代禽霍乱弱毒菌株(G190E40)强毒株豚鼠190代鸡胚传代布鲁氏菌羊5号弱毒菌株布氏羊型强毒株鸡胚传代猪瘟兔化弱毒株强毒株免传代马传贫驴白细胞弱毒株马传贫驴强毒株驴白细胞传代鸡痘弱毒株强毒株鸽鸦传代口蹄疫0型鼠化弱毒株牛源强毒株乳鼠传代鸭瘟弱毒株强毒株鸭胚传代鸡胚传代牛肺疫免化弱毒株牛肺疫强毒株兔传代四、对生产与检验用菌四、对生产与检验用菌(毒、虫毒、虫)种要求种要求原种的代号、来源、历史(包括分离、鉴定、选育或构建过程等),感染滴度,血清学特性或特异性,细菌的形态、培养特性、生化特性,病毒对细胞的适应性等资料要清楚。
1.1.生产用菌生产用菌(毒、虫毒、虫)种来源和特性种来源和特性生产用菌(毒、虫)种原始种子批、基础种子批建立要有相关的资料,包括各种子批的传代方法、数量、代次、制备、保存方法。
2.2.生产用菌生产用菌(毒、虫毒、虫)种种子批种种子批对生产用菌(毒、虫)种的基础种子,要有全面的鉴定,包括外源因子检测、鉴别检验、感染滴度、免疫原性、血清学特性或特异性、纯粹或纯净性、毒力稳定性、安全性、免疫抑制特性等。
3.3.生产用菌生产用菌(毒、虫毒、虫)种基础种子的全面鉴定种基础种子的全面鉴定检验用强毒株包括试行规程(草案)中规定的强毒株以及研制过程中使用的各个强毒株。
对已有国家标准强毒株的,应使用国家标准强毒株。
4.4.检验用强毒株检验用强毒株
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- 第三 生物制品 菌种 资料