PCR检测系统性能评价与验证.pptx

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根据Ct值的定量是精确和严格的，而传统的终点定量则比较粗放。

如果读者有兴趣的话，也可以假设PCR的效率（即e）为100%，从上式推算出定量PCR标准曲线的最佳斜率和Ct值的最佳范围。

7、怎样确定Ct值？

实验操作中，Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。

阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是Ct值。

基线范围的定义是从第3个循环起到Ct值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个循环之间。

早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在Ct值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。

显然，Ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，Ct值是一个完全客观的参数。

Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。

正常的Ct值范围在14-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

外标定量的数学模型,1，理论模型，外标参比品为纯净核酸无抑制性存在2，实际应用时参比品要覆盖提纯过程具可比性,理想模式与参比品,斜率A=-0.301扩增效率为100%作为优化依据截距B=logN0Ct值趋向于0时的模板拷贝数对数,。

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