昆仑雪菊挥发油抗氧化活性和抑制淀粉酶和糖苷酶活性研究0512.docx
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昆仑雪菊挥发油抗氧化活性和抑制淀粉酶和糖苷酶活性研究0512
2014届毕业生毕业论文
昆仑雪菊挥发油体外抗氧化活性及对α-淀粉酶和α-糖苷酶抑制作用研究
学生姓名林佩艳
学号7021210230
所属学院生命科学学院
专业应用化学
班级14—2
指导教师曾红
塔里木大学教务处制
目录
前言2
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1供试材料2
1.1.2实验试剂2
1.1.3主要设备3
1.2试验方法3
1.2.1挥发油的提取3
1.2.2昆仑雪菊挥发油的密度3
1.2.3挥发油的成分检测方法3
1.2.4昆仑雪菊挥发油的抗氧化活性研究4
1.2.5昆仑雪菊挥发油对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用5
2实验结果与分析5
2.1昆仑雪菊挥发油的得率5
2.2昆仑雪菊挥发油的成分分析5
2.3昆仑雪菊挥发油的体外抗氧化分析6
2.3.1昆仑雪菊挥发油DPPH自由基的清除能力6
2.3.2昆仑雪菊挥发油ABTS自由基的清除能力7
2.3.3昆仑雪菊挥发油羟基自由基的清除能力7
2.3.4昆仑雪菊挥发油超氧阴离子自由基的清除能力8
2.4昆仑雪菊挥发油对α-糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用9
2.4.1昆仑雪菊挥发油对α-糖苷酶的抑制能力9
2.4.2昆仑雪菊挥发油对α-淀粉酶的抑制能力9
3结论与讨论10
3.1结论10
3.2讨论10
参考文献11
致谢12
昆仑雪菊挥发油体外抗氧化活性及α-淀粉酶和α-糖苷酶抑制作用研究
林佩艳
(塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔843300)
(新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔843300)
摘要:
【目的】研究新疆昆仑雪菊挥发油的体外抗氧化活性及抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶作用。
【方法】采用水蒸气蒸馏法提取昆仑雪菊挥发油,用GC-MS法测定昆仑雪菊挥发油的成分和含量。
以BHT为阳性对照,昆仑雪菊挥发油对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力以及对α-淀粉酶和ɑ-糖苷酶的抑制作用。
【结果】昆仑雪菊挥发油有清除自由基和抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶活性的能力,昆仑雪菊挥发油对DPPH自由基,ABTS自由基,羟基自由基,超氧阴离子自由基在一定浓度范围内都有清除作用,其IC50值分别为0.7852±0.04μg/mL,0.0730±0.0214μg/mL,0.8289±0.0184μg/mL,7.9837±0.0082μg/mL;对α-淀粉酶和α-糖苷酶也有很强的抑制作用,浓度和抑制率在浓度范围内呈现正相关关系,其IC50值分别为0.1402±0.0082μg/mL、0.1538±0.0082μg/mL。
【结论】昆仑雪菊挥发油有体外抗氧化作用及抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶的作用。
关键词:
昆仑雪菊;挥发油;自由基;α-淀粉酶;α-糖苷酶
Kunlunsnowchrysanthemunessentialoilantibacterialantioxidantactivityresearch
peiyanlin
(tarimuniversitycollegeoflifesciences,xinjiangaral843300)
(xinjiangproductionandconstructioncorpslaboratoryofbiologicalresourcesprotectionoftarimbasin,xinjiangaral843300)
Abstract:
【objective】tostudythevolatileoilofxinjiangkunlunsnowchrysanthemuminvitroantioxidantactivityandinhibitionofalphaamylaseandalphaglycosidaseaction.【methods】kunlunsnowchrysanthemumvolatileoilbysteamdistillationextraction,kunlunsnowchrysanthemumbyGC-MSmethod,thecompositionandcontentofvolatileoil.Withbutylatedhydroxytolueneasthepositivecontrol,kunlunsnowchrysanthemumvolatileoilofDPPHfreeradical,ABTSfreeradical,hydroxylradicalandsuperoxideanionfreeradicalremovalabilityaswellastothealphaamylaseandɑglycosidicenzymeinhibition.【results】thekunlunsnowchrysanthemumnaphthascavengingfreeradicalsandinhibitingalphaandalphaglycosidicenzymeactivityofamylase,kunlunsnowchrysanthemumvolatileoilofDPPHfreeradical,ABTSfreeradical,hydroxylfreeradicals,superoxideanionfreeradicalshaveclearroleinthecertainconcentrationrange,itsIC50alueconcentrationwere1.8058±0.04μg/mL,0.336±0.0214μg/mL,1.99±0.0184μg/mL,13.9675±0.0082μg/mL;Toalphaamylaseandalphaglycosidicenzymeinhibition,concentrationandinhibitionratepresentpositivecorrelationintheconcentrationrange.【conclusion】thekunlunsnowchrysanthemumnaphthainvitroantioxidanteffectandinhibitingtheroleofalphaamylaseandalphaglycosidase.
Keywords:
kunlunsnow;chrysanthemumvolatileoil;freeradicalsof;alphaamylase;alphaglycosidase
前言
昆仑雪菊是具有新疆区域特色的菊屹品种之一。
昆仑雪菊又名“血菊”,维吾尔语“古丽恰尔”,是目前新疆唯一与雪莲齐名且具有降血压、降血脂等独特功效的稀有高寒野生植物,具有极高的药用价值[1]。
目前,新疆和田市政府组织有关专家对昆仑雪菊进行相关研究,并委托新疆药物研究所对昆仑雪菊进行相关药理学实验。
经研究发现,昆仑雪菊确有降血压、降血脂和降血糖的功效。
挥发油是具有广泛生物活性的一类重要成分,是古代医疗实践中较早注意到的药物,多具有祛痰、止咳、驱风、健胃、解热、镇痛、抗菌消炎等作用。
民间流传其还具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效,当花茶饮用,可治疗燥热烦渴、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒等症。
花茶,《神农本草经》中的记载:
“茶叶。
味苦寒……久服安心益气……轻身耐老”,“茶味苦,饮之使人益思、少卧、轻身、明目”,以及唐代陆羽的《茶经》和清代李时珍的《本草纲目》都有记载[2]。
昆仑雪菊有广阔的研究和发展前景,由此作为一种新型材料进入人们的视野。
挥发油在医药中具有消炎、抗过敏、抗突变和抗癌、驱虫作用、酶抑制作用、对中枢神经系统的作用、对呼吸系统的作用;在食品中有抗微生物、防腐、保鲜等作用[2]。
近年来,有关挥发油抗氧化活性的报道很多。
而昆仑雪菊挥发油作为一种新型材料进入人们的视野,昆仑雪菊挥发油的研究主要集中在挥发油的提取工艺及其成分分析等方面[3],2010年12月,新疆医科大学药学院张彦丽等报道了系统分析昆仑雪菊中挥发油的组成和相对含量[4-5],目前,暂且无对昆仑雪菊挥发油的体外抗氧化活性及对α-淀粉酶和α-糖苷酶的相关研究报道。
本文研究昆仑雪菊挥发油对体外抗氧化活性和抑制α-淀粉酶和ɑ-糖苷酶作用,探讨昆仑雪菊挥发油的含量与其清除自由基及抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶能力的相关性,期望对昆仑雪菊栽培品种的选育提供科学依据以及对昆仑雪菊挥发油的加工开发提供科学理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1供试材料
昆仑雪菊于2013年6月采自新疆和田地区昆仑雪菊栽培基地。
药材于60℃烘干,粉碎过40目筛,备用。
1.1.2实验试剂
试剂
规格
生产厂家
吐温20
AR
天津市致远化学试剂有限公司
无水乙醇
AR
天津永晟精细化工有限公司
DPPH
AR
天津市致远化学试剂有限公司
水杨酸
AR
天津市致远化学试剂有限公司
硫酸亚铁
AR
天津市致远化学试剂有限公司
邻苯三酚
AR
上海山浦化工有限公司
Tris
AR
西安化学试剂长
盐酸
AR
广东汕头市西陇化工厂
ABTS
AR
天津市致远化学试剂有限公司
过硫酸钾
AR
中国爱建试剂厂
α-淀粉酶
AR
天津市致远化学试剂有限公司
α-糖苷酶
AR
天津市致远化学试剂有限公司
磷酸钾缓冲液
AR
天津市致远化学试剂有限公司
碘液
AR
西安化学试剂厂
硝基苯酚
AR
原盛精细化工公司
PNPG
AR
天津市致远化学试剂有限公司
碳酸钠
AR
天津市化学试剂三厂
BHT
AR
天津市致远化学试剂有限公司
阿卡波糖
AR
天津市致远化学试剂有限公司
1.1.3主要设备
仪器名称
型号
生产厂家
GC-MS7890A-5975C气质联用仪
SKT-CJ-ZF
上海博迅
550-酶标仪
550-BAD
济南昊天
粉碎机
XT-250A
浙江省永康市红太阳机电有限公司
紫外可见风光光度计
BL-75G
上海博迅
移液枪
KE0020205
上海康敏
水浴锅
HH-S4
江苏金坛
提取器
WD700A
格兰仕
超声波清洗器
KQ-5200E
昆山
冰箱
BCD-216TMZL
海尔
电热恒温鼓风干燥箱
GZX-9420MBE
上海博迅
1.2试验方法
1.2.1挥发油的提取[6]
参照《中国药典》2010年版一部附录XD甲法记录的相对密度小于1.0的挥发油的测定方法,用挥发油测定器提取昆仑雪菊挥发油成。
将干燥的昆仑雪菊用粉碎机粉碎并过40目筛,称取粉末200.000g于1000mL圆底烧瓶中,加入一定量的蒸馏水,使料液比为(1:
15),浸泡过夜,置于电热套缓慢加热至沸,并保持微沸至4h,待挥发油提取器中油不再增加为止,冷却读数,收集挥发油,加少量无水硫酸钠干燥过夜,过滤,密封保存于−4℃冰箱,待用。
比较野生和培育的昆仑雪菊挥发油的得率,因为其含量高低也是评定菊花质量的重要标志[7]。
1.2.2昆仑雪菊挥发油的密度
参照《中国药典》2010年版一部附录XD甲法进行挥发油提取,《中国药典》2010年版第一部附录ⅦA进行挥发油密度测定。
取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶,装满莳萝子挥发油(温度低于20℃),插入中心有毛细孔的瓶塞,用滤纸将从塞孔溢出的液体擦干,置20℃恒温水浴中,放置若干分钟,随着供试液温度的上升,过多的液体将不断从塞孔溢出,随时用滤纸将瓶塞顶端擦干,待液体不再由塞孔溢出,迅速将比重瓶自水浴中取出,再用滤纸将比重瓶的外面擦净,精密称定,减去比重瓶的重量,求得供试品的重量后,将供试品倾去,洗净比重瓶,装满新沸过的冷水,再照上法测得同一温度时水的重量,按以下公式计算,即得,实验重复3次。
昆仑雪菊挥发油的相对密度=昆仑雪菊挥发油的重量/水的重量
1.2.3挥发油的成分检测方法
用GC-MS方法检测:
气相色谱条件:
石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);按照设定程序升温,由初始状态50℃以5℃/min升温到200℃,接着以20℃/min升温到300℃,温度达到300℃时保持5分钟;进样口温度为230℃;柱前压55.8kPa;进样量0.5μL;分流比20∶1;载气为高纯度氦气。
质谱条件:
离子源为EI源;离子源温度230℃;接口温度280℃;电子能量70eV;溶剂延迟3min;质量范围30~600amu。
定性、定量分析:
采用日本SHIMADZUGCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪对制得的昆仑雪菊挥发油进行了分析。
GC条件:
Rtx-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);进样口温度240℃;分流进样,分流比20∶1;挥发油进样量1μL;载气(99.999%的高纯氦)恒线速度40cm/sec;吹扫气流量3mL/min。
升温程序:
初始温度70℃,保持2min;再以10℃/min程序升温至250℃,保持10min。
MS条件:
电子轰击源(ElectronImpact,EI),电子能量为70eV,离子源温度200℃,接口温度220℃。
选取SCAN模式时,质量扫描范围为30~500(m/z),溶剂延迟2.5min。
根据保留时间,同时对各化合物质谱在NIST数据库进行相似检索,对各组分进行定性分析,其相对含量采用面积归一化法进行计算。
1.2.4昆仑雪菊挥发油的抗氧化活性研究[8-10]
昆仑雪菊挥发油DPPH自由基清除能力
配置浓度为23.29μg/mL挥发油溶液,0.2mmol/L的DPPH,1%的吐温20。
用96微孔板筛选法,先向96孔板的前六排的1至8个孔分别加100μL1%吐温20溶液,再分别向A、B两排加入100μLDPPH;C、D、E、F四排的第一个孔分别加入100μL的挥发油,依次稀释至八个浓度梯度,再分别向A、B两排加入100μLDPPH溶液,E、F两排加入100μL1%吐温20。
在室温下静置20min,然后再517nm处测定吸光值。
以BHT做阳性对照,其原溶液浓度为2000μg/mL。
式中:
A0:
100μLDPPH·溶液+100μL1%吐温20溶液的吸光度值;
A1:
100μLDPPH·溶液+100μL挥发油溶液的吸光度值;
A2:
100μL1%吐温20溶液+100μL挥发油溶液的吸光度值。
昆仑雪菊挥发油ABTS自由基的清除能力
将5mL7mmol/LABTS和88μL2.45mmol/L(1:
0.35)过硫酸钾混合,在室温、避光的条件下静置16h,形成ABTS+储备液,该储备液在室温避光条件下很稳定,使用前用去离子水稀释成工作液,使其在734nm处吸光值在0.700±0.2,在配制25μg/mL的昆仑雪菊挥发油。
用96微孔板筛选法,取不同浓度的挥发油30μL再加入270uLABTS+工作液,在734nm波长处测得吸光度值A1,以蒸馏水代替ABTS+·溶液测吸光度A2,以蒸馏水代替挥发油测定空白对照A0。
式中:
A0:
30μL蒸馏水+270uLABTS+溶液
A1:
30μL挥发油+270uLABTS+溶液
A2:
30μL挥发油+270uL蒸馏水
昆仑雪菊挥发油羟基自由基的清除能力
用Fenton反应法产生羟基自由基(·OH)。
H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生经自由基化学反应如下:
H2O2+Fe2+→·OH+OH-+Fe3+
用·OH氧化水杨酸产生有色物质,该产物在510nm处有强吸收峰,若体系中加入清除·OH的物质,则会减少有色物质的生成,吸收度降低。
吸光度越低,清除羟基自由基的效果越好。
配置浓度分别为25μg/mL的挥发油溶液,9mmol/L的水杨酸,9mmol/L的FeSO4溶液,8.8mmol/LH2O2。
用96微孔板筛选法,向A、B两排分别加入100μL的1%吐温20,在分别向这两排的第一个孔加入100μL挥发油溶液依次稀释梯度,再各加20μL浓度9mmol/L的FeSO4和40μL浓度9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,最后加入40μL浓度为8.8mmol/L的H2O2,启动反应,在室温下反应30min,于510nm波长处测得吸光度值A1,用同种方法用蒸馏水替代水杨酸测得A2,蒸馏水代替挥发油溶液作空白调零,测定其吸光度值A0,记录数据。
同样的方法以BHT做阳性对照,原样品液浓度为2000μg/mL。
式中:
A0:
40uL水杨酸·乙醇溶液+100uL蒸馏水的吸光度值;
A1:
40uL水杨酸·乙醇溶液+100uL挥发油溶液的吸光度值;
A2:
40uL蒸馏水+100uL挥发油溶液的吸光度值。
昆仑雪菊挥发油超氧阴离子自由基的清除能力
采用邻苯三酚自氧化法,取试管编号加入50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH值为8.2)4.5mL和蒸馏水4.2mL,混匀后在室温下反应20min,取出后立即加入25mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL,迅速摇匀后倒入比色杯中,于319nm下每隔30s测吸光度值A0,至4min时停止,计算每分钟吸光度的增加值。
样品管在加邻苯三酚前,先加雪菊挥发油溶液1mL,蒸馏水减少,测得吸光度值A1,并且以蒸馏水替代邻苯三酚测出样品背景值A2。
雪菊挥发油溶液终浓度为12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1μg/mL。
同样方法设BHT为阳性对照,原样品液浓度为2000μg/mL。
式中:
A0:
4.5mLTris-HCI+4.2mL蒸馏水+0.3mL邻苯三酚溶液
A1:
4.5mLTris-HCI+3.2mL蒸馏水+1mL挥发油+0.3mL邻苯三酚溶液
A2:
4.5mLTris-HCI+3.5mL蒸馏水+1mL挥发油
1.2.5昆仑雪菊挥发油对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用
昆仑雪菊挥发油对α-淀粉酶的抑制能力[15-16]
称取淀粉酶0.0523g,定容至50mL,配制0.01mol/L的磷酸钾缓冲溶液,称取磷酸二氢钾0.4495g,和磷酸氢二钾0.1924g定容至100mL后用NaoH调节PH=6.8,称取4.9948g可溶性淀粉溶于5mL蒸馏水中,然后缓慢加入100mL沸腾的蒸馏水中再煮沸2min后,冷却便可得到淀粉溶液,称取0.2516g碘及0.7006g碘化钾然后溶解定容到100mL,在吸取1mL碘液稀释得到0.01mol/L的碘液。
吸取0.8mL盐酸定容到50mL得到浓度为0.2mol/L的盐酸备用。
用96微孔板筛选法,先取25μg/mL昆仑雪菊挥发油100uL稀释8个浓度梯度,再分别加入15uL酶液,在55℃预热20min,然后加入20uL淀粉溶液混匀准确反应5min,立即加入50uL盐酸终止反应,加入10uL碘液,摇匀,在660nm处测吸光度值A1同样方法用蒸馏水代替酶液侧得吸光度值A2,用蒸馏水代替昆仑雪菊挥发油做空白,测得吸光度值A0.
昆仑雪菊挥发油对α-葡萄糖苷酶的抑制能力[17-18]
磷酸钾缓冲液的配置,取1.3689g磷酸二氢钾,磷酸氢二钾2.2832g分别配置成0.1mol/L将两者半对半配置成PH=6.8的磷酸缓冲液,称取对硝基苯酚0.0072g,用配置好的磷酸缓冲液配置成1000mmol/L的对硝基苯酚。
称取0.0387gPNPG用磷酸缓冲液配置成2.5mmol/L的PNPG。
称取1.0634gNa2CO3配置成0.2mol/L的溶液。
标准曲线的配置,将配置好的1000μmol/L的PNP稀释成50100150200300400μmol/L的不同浓度,取不同浓度的溶液160μL加入0.2mol/L的碳酸钠的水溶液80μL摇匀,在405nm处测得吸光度值,并以吸光度值为纵坐标,浓度为横坐标,做出标准曲线。
用96微孔板筛选法,加入112μL磷酸缓冲液,加入0.2U/mLα-葡糖糖苷酶溶液20μL,DMSO8μL再加入50μL的不同浓度的挥发油,在37℃恒温15min,然后再加入2.5mmol/L的PNPG20μL,在37℃下再恒温15min,再加入0.2mol/LNa2CO380μL在405nm波长下测定吸光度A1。
测定样品的本底吸光度值A2,并用不加挥发油样品测定酶的活力做空白对照,测得A0。
用同种方法以阿卡波糖作为阳性对照,阿卡波糖原溶液浓度为500μg/mL。
2实验结果与分析
2.1昆仑雪菊挥发油的得率
昆仑雪菊挥发油的得率是0.3%,密度为:
0.9314。
2.2昆仑雪菊挥发油的成分分析
图1昆仑雪菊挥发油色谱分析
表1昆仑雪菊挥发油GC/MS分析结果
PeakNo.
保留时间
中文名称
英文名称
相对含量(%)
1
6.711
α-蒎烯
1R-.alpha.-Pinene
11.70
2
7.786
β-水芹烯
beta.-Phellandrene
0.51
3
8.288
β-月桂烯
beta.-Myrcene
1.86
4
8.661
α-水芹烯
alpha.-Phellandrene
1.92
5
9.260
1-甲基-2-异丙基苯
1-methyl-2-(1-methylethyl)benzene
1.09
6
9.414
柠檬烯
Limonene
52.56
7
9.672
3-蒈烯
3-carene
1.44
8
12.298
烯烃
(4E,6Z)-2,6-Dimethyl-2,4,6-octatriene
0.59
9
12.761
马鞭烯醇
Bicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-ol,4,6,6-trimethyl
0.83
10
13.405
1,3-环庚二烯
1,3-Cycloheptadiene
0.61
11
18.290
长叶烯
Longifolene-(V4)
3.67
12
20.266
石竹烯
Caryophyllene
1.45
13
20.653
三环烯
Tricyclene
1.22
14
21.129
桧烯
Sabinene
0.61
15
21.824
姜烯
zingiberene
7.63
16
22.082
龙脑烯
Campholenicaldehyde
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