实验十血痕的DNA 提取及STR 分析一、血痕DNA 提取在DNA.docx
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实验十血痕的DNA提取及STR分析
一、血痕DNA提取
在DNA分析技术运用于实际检案的过程中,血痕是最常见的检材之一。
对血痕提取DNA,再进行PCR扩增特定基因位点,然后电泳显色检测,这是常用的法医物证检验方法。
目前,用于提取血痕DNA的方法很多,不同的方法有不同的优缺点,其适用的分析技术也有不同。
而且,法医检案的实际应用过程中经常遇见不少问题,比如:
微量血痕的DNA提取,血痕中含有过多的杂质等等。
所以,在血痕DNA提取方面,我们应该了解多一点的方法。
因此,本次实验介绍以下几种常用的血痕DNA提取的方法供同学们学习。
分别是:
chelex-100法、酚-氯仿法、碱性裂解法、以及这些方法的改良。
(--)Chelex-lOO法
1.原理:
细胞中的DNA一般与蛋白质结合,抽提DNA的过程就是破碎细胞,去除与DNA结合的蛋白质、多糖、脂类(也包括去除其他核酸),最后分离、纯化所需的DNA的过程。
在DNA的提取方法中,我们要用到蛋白酶K、SDSo蛋白酶K的作用是消化与DNA结合的蛋白质,释放DNA。
SDS的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组蛋白等从DNA分子上解联。
Chelex-100法中,chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物,对多价金属离子有鳌合作用,可防止DNA在煮沸加热时被降解,同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。
这样既可减少DNA的损失,又可消除扩增中的一些抑制因素,因此血痕DNA采用chelex-100法,由于其快速、实用而被广大法医物证工作者所用。
2.仪器设备与试剂:
2.1仪器设备:
离心机、进样器、1.5mlEppendorf离心管、水浴锅、振荡器。
2.2试剂:
灭菌去离子水,chelex-100
3.方法:
3.1检材用量:
对于大量血痕(如血纱布),剪取约1xIcn?
大小,不可过多否则会抑制PCR反应。
如果血痕属微量血痕,可直接用进样器吸取20-40ul灭菌去离子水,然后在血痕处反复吹打,将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。
3.2取适量血痕检材置1.5mlEP管中,加入11灭菌无菌水浸泡20min,>10000rpm离心3min,用lOOOul进样器小心地吸去上清液。
3.3力口5%chelex-100200ul,于水浴锅中56℃水浴30min,振荡混匀。
3.4沸水中煮lOmin,取出后立即置于冰上3min,>10000rpm离心Imin。
上清液即为DNA提取液,可在2-6℃保存1个月,在-20C长期保存。
注意事项:
对部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材,经一次chelex-100的处理,仍不能扩增成功,这可能是由于以下几个原因:
①血痕过于陈旧,血色素无法溶解下来,使血色素对扩增的抑制增强,导致扩增失败。
②血痕受泥沙或载体色素的影响,使扩增受到抑制。
③血痕载体吸附力强,导致DNA提取率降低。
④血痕量太少,超出检验灵敏度。
针对以上几种影响因素,进行一些改良处理:
①对难于溶解的陈旧血痕,可加入1/10体积的10%SDS,促进血色素的溶解,易于洗涤,减少血色素对扩增的抑制。
②对受泥沙或载体色素影响的血痕,可对首次DNA提取液进行二次提取,使模板被稀释,减少载体的干扰,进一步去除模板中的扩增抑制物。
③对载体吸附力强的血痕,可增加浸泡时间,同时也可结合上述方法。
④对于量少而受污染的血痕,经上述处理后,再经超滤柱过柱浓缩,使模板DNA浓度达到可检测范围。
在检案过程中,检材经常是受多种因素的影响,因此可综合利用上述几种处理方法。
(二)酚-氯仿法
1.原理:
本实验采用酚、氯仿反复抽提,使与DNA结合的蛋白质解离、去除。
氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
酚起萃取的作用。
试验中还要用到异戊醇,有助于消除抽提过程中出现的泡沫。
2.仪器设备与试剂:
2.1仪器设备:
水浴锅、振荡器、离心机、进样器、1.5mlEP管
2.3试剂:
灭菌去离子水、STE(氯化钠、Tris、EDTA)缓冲液、蛋白酶K、10%SDS、苯酚/氯仿/异戊醇混合物(25:
24:
1)、氯仿/异戊醇混合物(24:
1)、5mol/L氯化钠、冰无水乙醇、70%乙醇
3.方法:
3.1取适量血痕检材置于1.5mlEP管中,加入1ml无菌水浸泡20min,>10000rpm离心3min,弃去上清。
3.2加入500)j1STE液悬浮沉淀物,加入20日110%SDS及10mg/ml蛋白酶K4|il,54℃水浴消化3小时。
3.3离心取上清液至另一EP管中,加入500口1苯酚/氯仿/异戊醇混合物,振荡到出现絮状物,>1OOOOrpm离心3min。
3.4转移上层水相至另EP管中,加入氯仿/异戊醇混合物,振荡,>10000rpm离心3min。
3.5取上层水相,加入30口15moi/L氯化钠和1ml冰无水乙醇,振荡,10000rpm离心3min,去除乙醇。
3.6取絮状物加入500口170%乙醇,振荡,>10000rpm离心3min。
3.7弃上清液,加入无菌水100rL使其溶解,4℃保存备用。
注意事项:
酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一,无论是血液还是血痕标本均适用,所提取的DNA纯度高,可满足各种分子生物学检测技术的需要,但该法操作较为繁琐、耗时长,影响了其在实践工作中的广泛应用。
(三)碱性裂解法
1.原理:
碱性裂解法是指在强碱作用下,使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅速发生电离,从而快速破坏蛋白质的一级结构。
正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用,所以,检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞膜及核膜,使核酸酶变性及DNA释放。
此时,DNA的一级结构是相对完整的。
这个原理在细菌质粒DNA提取中运用较多。
1.仪器设备与试剂:
1.1仪器设备:
0.5mlEP管、水浴锅、离心机
1.2试剂:
裂解液0.2mol/LNaOH溶液(国产分析纯)。
中和液0.04mmol/LTris-HCl(pH7.5)进口分装。
2.方法:
2.1取适量血痕于0.5mlEP管中,加入20)110.2mol/LNaOH溶液,80℃保温5min(若为陈旧血痕,可适当增加保温时间5〜10min)o
2.2加入18040.04mlnol/LTris-HCl(pH7.5)。
离心,4℃保存备用。
注意事项:
血痕要求在75〜80℃之间保温5min,若检材为陈旧性,尚应适当延长保温时间5〜10mine碱性裂解法提取生物检材DNA只需一个离心管,一次完成DNA的提取,虽然不能提取100%纯度的DNA,但极大地避免了常规方法反复提纯必然导致的DNA在量上的损失。
因此,本方法对微量检材DNA的提取有着更广泛的应用前景。
与Chelex-100提取法相比较,碱性裂解法有以下特点:
①耗时少,碱性裂解法提取检材DNA一般需5min。
②碱性裂解法提取DNA所耗检材少,灵敏度高。
③碱性裂解法所需仪器及设备只是一个0.5ml小离心管,试剂只是NaOH及Tris-HCl等,这些均是普通实验室常规材料及试剂,大大节约了资金,减少了对国外试剂及仪器的依赖。
同时既适合普通的银染检测,又适用于自动DNA片段分析仪进行片段分析。
④由于所用试剂中含有强碱,可以有效抑止Tag酶抑制剂的作用,所以对于相同的位点,可以取得跟chelex-100相似的扩增效果。
(四)改良方法
将chelex-100法或碱性裂解法处理的血痕,用等体积的饱和酚-氯仿(1:
1)处理一次,再用冰无水乙醇沉淀,挥干后,加适量无菌水溶解。
这样提取的DNA,经过PCR扩增电泳后,显示结果会更好。
二STR基因座的PCR扩增及电泳检测
方法同实验二
[注意事项]
1.对于微量血痕的DNA样本,往往需在扩增反应体系中加入更多的DNA模板,以提高扩增成功率。
有时,可能需要进行多次扩增方能成功。
2.对于陈旧性检材,考虑到核酸降解的可能,应尽可能选择扩增片段较小的STR基因座进行扩增和检测。
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