蛋白组学实验流程.docx

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蛋白质组学实验技术流程

1蛋白提取

目的：

尽可能多的将植物组织中蛋白质提取出来。

1.1试剂和溶液

（1）匀浆缓冲液

本实验室蛋白质提取常用的匀浆缓冲液有两种：

1）Tris-HCl匀浆缓冲液；2）磷酸（PBS）匀浆缓冲液。

1）Tris-HCl匀浆缓冲液：

20mM（mmol/L）Tris-HCl（pH7.5），250mM蔗糖，10mMEDTA，1mMPMSF（使用前加入），1mMDTT（使用前加入），1%w/vTritonX-100。

2）磷酸（PBS）匀浆缓冲液：

50mMPBS（pH7.5），250mMsucrose蔗糖，1％（g/mL）PVPP，2mMEDTA-Na2，2％（v/v）β-巯基乙醇（使用前加入），1mMPMSF（使用前加入）。

[附50mMPBS（pH7.5）缓冲液的配制：

称取NaHPO4.12H2O2.9797g和NaH2PO4.2H2O0.1622g溶于100mL超纯水]

（2）蛋白抽提液：

pH7.5Tris-HCl饱和酚。

（3）蛋白沉淀液：

0.1M醋酸铵（配制溶液为甲醇），即200mL甲醇中加入1.54g醋酸铵。

（4）蛋白沉淀洗涤液：

丙酮（内含13mMDTT），即100mL丙酮加入0.154gDTT。

1.2操作步骤

（1）准备冰块和液氮，并打开冷冻离心机（SorvallBiofugeStratos，Germany）低速转动（1000rpm）降温至-4℃；

（2）将植物组织鲜样用液氮研磨至细粉状，再加入匀浆缓冲液和2％（v/v）巯基乙醇（或1mMDTT）以及1mMPMSF继续在冰浴下研磨成匀浆。

（注意：

一般以0.5g植物鲜样加2mL的匀浆缓冲液的量液氮研磨，另外研磨的粉状物越细越好。

）

（3）研磨后的匀浆液装入离心管，加入同体积的pH7.5Tris-HCl饱和酚（酚提取蛋白），放入振荡器入振荡15-30min后，-4℃低温离心机15000rpm离心15min离心取酚相。

（4）离心取的酚相，加入3倍体积的醋酸铵，放入－20℃冰箱沉淀过夜。

（5）离心取沉淀，洗涤沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮（－20℃），每次洗完后都要离心。

（6）离心后的蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪（ChristCT02-50，Germany）冻干。

（如果不立即使用，蛋白干粉冻于－20℃。

）

2蛋白裂解和定量

目的：

尽可能增大蛋白干粉的溶解性，并对溶解的蛋白样品进行准确定量。

（1）样品裂解液：

7M尿素，2M硫脲，4%w/vCHAPS，2%v/v两性电解质（Ampholine，1.6%v/vpH5～8，0.4%v/vpH3.5～10），1%w/vDTT（使用前加入）。

（2）Bradford存储液和工作液，参见《蛋白质技术手册》（汪家政、范明）56-60页。

3双向电泳

目的：

通过双向电泳将蛋白质按等电点和分子量分离，以获得特异蛋白质。

本实验室常用的电泳方法IPG固相电泳。

3.1试剂和溶液

（1）不同pH梯度范围的IPG胶条的规格选择

pHRange

3-10

3-10nonlinear

4-7

3-6

5-8

7-10

3.9-5.1

4.7-5.9

5.5-6.7

6.3-8.3

生物体中大部分蛋白的等电点在pH4－8之间，线性宽pH范围的胶条（pH3－10）可以在同一块凝胶上显示样品中绝大多数的蛋白质，但大量的蛋白点都集中在胶条的中间，两边的蛋白点较少，从而造成中间的分辨率较低。

非线性宽pH范围的胶条（pH3-10nonlinear）将pH4－8之间的距离相对拉大，而两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好地分离大部分pI4－8的蛋白质。

使用窄范围重叠pH梯度的胶条可以大大提高分辨率和灵敏度。

IPG胶条的长度：

7cm、11cm、17cm、18cm、24cm

（2）IPG平衡液

50mMTris-HCl（pH6.8），6M尿素，30%v/v甘油，2.5%w/vSDS，1%w/vDTT（第一次平衡前加），2.5%w/vIAA（第二次平衡前加）。

（3）浓缩胶

浓缩胶贮存液：

29.2%w/v丙烯酰胺，0.8%w/v甲叉双丙烯酰胺。

附100mL浓缩胶储液配方：

Acylamide29.2g

Bis（甲叉）0.8g

超纯水定溶于100mL

浓缩胶缓冲液：

200mMTris-HCl（pH6.8），0.2%w/vSDS。

附100mL浓缩缓冲液配方：

Tris3.03g

SDS0.2g

加80mL超纯水，用盐酸调至pH6.8后定容至100mL

附浓缩胶（4％）配制：

总体积

10mL

15mL

18mL

浓缩胶储液

1.5mL

2.25mL

2.7mL

浓缩胶缓冲液

2.5mL

3.75mL

4.5mL

超纯水

6mL

9mL

10.8mL

10%APS

100μL

150μL

180μL

TEMED

20μL

30μL

36μL

（4）分离胶

分离胶贮存液：

30%w/v丙烯酰胺，0.135%w/v甲叉双丙烯酰胺。

附100mL分离胶储液配方：

Acylamide30g

Bis（甲叉）0.135g

超纯水定溶于100mL

分离胶缓冲液：

1MTris-HCl（pH8.8），0.27%w/vSDS。

附100mL分离胶缓冲液配方：

Tris12.11g

SDS0.27g

加80mL超纯水，用盐酸调至pH8.8后定容至100mL。

附分离胶（12%和15%）70mL（两块板）配制：

总体积

12%分离胶70mL

15%分离胶70mL

分离胶储液

28mL

35mL

分离胶缓冲液

26mL

26mL

超纯水

16mL

8.5mL

10%APS

400μL

400μL

TEMED

80μL

80μL

（5）0.5%琼脂糖：

0.5g琼脂糖（IPG需要用低熔点琼脂糖）溶解在100mL电泳缓冲液，加热融化，于室温保存。

（6）SDS-PAGE电极液

0.3%w/vTris，1.44%w/v甘氨酸，0.1%w/vSDS。

也即，1L电极缓冲液配方为：

SDS1g

甘露醇14.4g

Tris3g

溶至1L水中。

（7）固定液：

40%v/v乙醇，10%v/v冰乙酸。

（8）染色液

本实验室用到的染色液有三种：

1）R-250染色液（常用）

0.116%w/v考马斯亮蓝（CBB）R-250，25%v/v乙醇，8%v/v冰乙酸。

附考马斯亮蓝染液（1L）：

考马斯亮蓝R-2501.0g

甲醇450mL

蒸馏水450mL

冰醋酸100mL

2）G-250染色液（常用）

0.12%G-250,10%（NH4）2SO4，10%H3PO4，20%甲醇

附1LG-250染色液配方：

100mlH2O+100mlH3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状（NH4）2SO4（边搅拌，边加）先溶解,然后加入1.2gG-250再溶解（其实不能真正溶解），用水定容到800ml，边搅拌边加入200ml甲醇，终体积1000ml。

3.2操作步骤

样品裂解：

5mg蛋白干粉加入裂解液，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10℃15000rpm离心30min去除沉淀，取上清测量样品蛋白浓度。

IPG上样

根据蛋白浓度选择适当的体积的样品上样（5mg蛋白）。

取蛋白样品，用移液枪沿着水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品；然后从-20℃冰箱中取出冷冻保存的IPG预制胶条（18cmpH4-7线性），放于室温1分钟。

再用镊子轻轻的去除IPG胶条上的保护层，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上，为了让胶条更好的吸收样品溶液，避免样品溶液跑到胶条背面的塑料支撑膜上，也不要让胶条下面的溶液产生气泡。

如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

最后，在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油慢慢加在塑料支撑膜上；

等点聚焦

水化12hr后，将胶条转入聚焦盘。

分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝上置于聚焦盘，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。

在胶条和电极的之间加上湿润的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分；连通电源选择聚焦参数进行等电聚焦电泳。

表格3聚焦参数

Steps

Voltage（V）

Time（h）

Step1

300（gradient）

1

Step2

500

1

Step3

1000

1

Step4

8000（gradient）

8

Step5

8000

1

第二向SDS-PAGE电泳

平衡

聚焦完成后取出IPG胶条，用滤纸吸去附着的矿物油后将其放入1%DTT的平衡缓冲液中平衡15min，再转入2.5%IAA平衡缓冲液中平衡15min。

平衡过程在摇床上进行。

电泳

将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（15%分离胶，4%浓缩胶）的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封（避免产生气泡），加入电极缓冲液（含0.001%溴酚蓝显色剂）进行SDS－PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源。

（2）固定、染色和脱色

电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30min。

固定好的凝胶置于CBBR-250染色液中，室温下染色3小时以上。

倒出染色液（可以回收利用3次以上），加入脱色液进行脱色。

15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止。

固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。

（3）蛋白质凝胶扫描

CBB染色后的凝胶用UniscanM3600扫描仪直接扫描。

扫描参数设置为256阶灰度、300dpi透射扫描，图像保存为Tiff格式。

（4）PDQuest软件进行图像分析

扫描后的图像用PDQuest7.1.0软件（Bio-rad）进行分析，包括蛋白点的检测、匹配以及标准化等。

通过比较分析寻找出显著差异的蛋白点。

软件使用参照用PDQuest软件使用说明。