生物化学-第三版-笔记.doc
- 文档编号:30802142
- 上传时间:2024-01-28
- 格式:DOC
- 页数:69
- 大小:436KB
生物化学-第三版-笔记.doc
《生物化学-第三版-笔记.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生物化学-第三版-笔记.doc(69页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
生物化学笔记
第一章氨基酸与蛋白质
1.1氨基酸
(一)蛋白质水解最后成为氨基酸混合物
酸水解得19种L-AA,色氨酸破坏。
碱水解得色氨酸,其余氨基酸消旋破坏。
酶水解不消旋破坏,但水解不彻底。
(二)α-氨基酸的一般结构
生物体内已发现氨基酸180种,常见氨基酸20种
1.2氨基酸的分类:
常见蛋白质氨基酸,不常见蛋白质氨基酸,非蛋白氨基酸
(一)常见蛋白质氨基酸,或称基本氨基酸。
每个氨基酸可用三个字母或单字母简写表示。
按侧链R基不同进行分类。
(1)按R基化学结构分类
1.脂肪族氨基酸15个
①.中性氨基酸5个
甘氨酸Glycine氨基乙酸GlyG无旋光
丙氨酸Alanineα-氨基丙酸AlaA
缬氨酸Valineα-氨基-β-甲基丁酸ValV
亮氨酸Leusineα-氨基-γ-甲基戊酸LeuL
异亮氨酸Isoleucineα-氨基-β-甲基戊酸IleI
②.含羟基或硫氨基酸4个
丝氨酸Serineα-氨基-β-羟基丙酸SerS
苏氨酸Threonineα-氨基-β-羟基丁酸ThrT
半胱氨酸Cysteineα-氨基-β-基丙酸CysC
甲硫氨酸Methionineα-氨基-γ-甲硫基丁酸MetM
③.酸性氨基酸及其酰胺4个
天冬氨酸Asparticacidα-氨基丁二酸AspD
谷氨酸Glutamicacidα-氨基戊二酸GluE
天冬酰胺Asparagineα-氨基丁二酸一酰胺AsnN
谷氨酸胺Glutamineα-氨基戊二酸一酰胺GlnQ
④.碱性氨基酸2个
赖氨酸Lysineα,ε-二氨基已酸LysK
精氨酸Arginineα-氨基-δ-胍基戊酸ArgR
2.芳香族氨基酸3个
苯丙氨酸Phenylalanineα-氨基-β-苯基丙酸PheF
酪氨酸Tyrosineα-氨基-β-对羟苯基丙酸TyrY
色氨酸Tryptophanα-氨基-β-吲哚基丙酸TrpW
3.杂环族氨基酸2个
组氨酸Histidineα-氨基-β-咪唑基丙酸HisH
脯氨酸Prolineα-吡咯烷羧酸ProP
(2)按R基极性性质分类
1.非极性R基8个
Ala(A)Val(V)Leu(L)Ile(I)Pro(P)
Phe(F)Trp(W)Met(M)
2.极性不带电R基7个
Gly(G)Ser(S)Thr(T)Cys(C)Tyr(Y)
Asn(N)Gln(Q)
3.带正电荷R基3个
Lys(K)Arg(R)His(H)
4.带负电荷R基2个
Asp(D)Glu(E)
另外Asx(B):
Asp(D),Asn(N)
Glx(Z):
Glu(E),Gln(Q)
两个Cys常氧化形成胱氨酸Cystie
(二)不常见蛋白质氨基酸P128
为相应常见氨基酸修饰而来,如:
5-羟赖氨酸,4-羟哺氨酸,γ-羧基谷氨酸,焦谷氨酸,磷酸丝氨酸,甲状腺素等。
(三)非蛋白氨基酸P129
1.L型α-氨基酸衍生物P128
2.β、γ或δ-氨基酸
3.D-氨基酸,如D-Glu和D-Ala
常见有:
肌氨酸(N-甲基甘氨酸),β-丙氨酸,γ-氨基丁酸,瓜氨酸,鸟氨酸,高半胱氨酸。
1.3氨基酸的酸碱化学
(一)氨基酸两性解离
-H+-H+
A+A0A-
(质子供体)+H++H+(质子受体)
Ka1=[A0][H+]/[A+]pH=pKa1+lg[A0]/[A+]
Ka2=[A-][H+]/[A0]pH=pKa2+lg[A-]/[A0]
综合pH=pHa+lg[质子受体]/[质子供体]
由此1.由pH值、AO/A+或A-/A0测pKa
2.pKa为常数,由pH计算A0/A+或A-/A0
3.由[质子受体]/[质子供体]可计算pH
(1)氨解酸的pKa测定
甘氨酸解离曲线P131图3-9
1molGly溶于水,溶液pH=6.0
用1molNaoH溶液滴定得曲线B,消耗0.5mol时,在pH9.6处有一拐点,此时[A0]=[A-]pH=pKa2测出pKa2=9.6
用1molHcl滴定得曲线A,当消耗0.5molHCl时得一拐点,pH=pKa1测出pKa1=2.34
带有可解离R基的氨基酸相当于三元酸,有三个pKa值,Glu和Lys滴定曲线见P132图3-10
(二)等电点
氨基酸或其他带电颗粒处于净电荷为零的兼性离子状态时介质的pH值,用pI表示,又称等电pH。
对于Gly,pI=5.97,为曲线A和曲线B之间的拐点,Gly为兼性离子,净电荷为零。
等电点pH值计算:
pI=1/2(pKa+)+pKa)
GlypI=1/2(2.34+9.60)=5.97
对于带可解离R基的氨基酸如Asp的pKa,pKa1=2.09pKa2=3.86pKa3=9.82
等电点pIP=1/2(pKa+pKa2)=1/2(2.09+3.86)=2.98
同理推出LyspI=9.74
P133表3-3列出20种氨基酸的pKa值和pI可做常数用,其中七个氨基酸R基有pKa值。
1.4氨基酸的光学性质
(一)旋光性一个无旋光Gly17个含一个不对称碳原子,两个含两个不对称碳原子Thr和Ile,有四种光学异构体。
胱氨酸分子内部对称有内消旋体,有三种异构体。
比旋光为氨基酸物理常数之一,但随pH值变化常见氨基酸比旋光度可用来鉴别氨基酸,P144表3-4
(三)氨基酸的紫外吸收
λmax(nm)ε(摩尔消光系数)
Phe2572.0×102
Tyr2751.4×103
Tvp2805.6×103
蛋白质在280nm波长下测光吸收,光吸收值越大,相对纯度越高,常用在蛋白质提纯过程。
1.5蛋白质的共价结构
(一)蛋白质氨基酸首尾相连形成蛋白质。
平均含氮量为16%
蛋白质含量=蛋白氮×6.25
从细菌到人类所有物种的蛋白质都由这一组20种氨基酸构成。
1.单纯蛋白质:
仅由氨基酸组成,如核糖核酸酶,肌动蛋白等。
见P158
表4-1。
2.缀合蛋白质:
除氨基酸外,还有非蛋白部分,称为辅基或配基,如血红蛋白、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等,见P158表4-2。
(二)蛋白质功能
生物界蛋白质种类估计有1010~1012种,20种氨基酸全排列为Anm=2020。
1.催化(酶):
生物体内化学反应几乎都是在酶催化下进行的。
2.调节:
基因表达调控中的蛋白因子,阻遏蛋白和激素中许多为蛋白质,如胰岛素等。
3.转运:
血红蛋白输氧气,细胞色素C传递电子。
4.贮存:
如种子中谷蛋白,蛋中卵清蛋白。
5.运动:
肌动蛋白,驱动蛋白。
6.结构:
胶原蛋白,α-角蛋白。
7.信息传递:
受体蛋白。
8.防御和进攻:
免疫球蛋白,毒蛋白如蛇毒。
9.异常蛋白:
胶质蛋白。
(三)蛋白质的构象
为蛋白质具有的特有空间结构或称三维结构。
在生理条件下,蛋白质只有一种或很少几种构象在能量上是有利的。
功能来自构象:
为表达蛋白质结构上不同组织层次,一般采用下列专门术语:
1.一级结构:
又称化学结构,指蛋白质多肽链氨基酸连接在一起的顺序,包括二硫键位置,为共价键连接的全部情况。
2.二级结构:
多肽链借助氢键排列成自己特有的α-螺旋和β-折叠片段(P161图4-1),这些片段构成规则结构,并沿一维方向伸展。
3.三级结构:
由二级结构元件(α-螺旋,β-折叠等)构造成的总三维结构,包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间相互关系。
4.四级结构:
寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。
寡聚蛋白是由两条或多条多肽链构成,其中每条多肽链称为亚基或亚单位。
1.6肽:
P162
肽为氨基酸的线性聚合物,蛋白质是由一条或多条多肽链构成。
(一)肽和肽键结构
肽的命名从N端开始到COOH端,氨基酸残基按顺序从左向右写,-NH2末端在左,-COOH端在右。
如Ser-Gly-Phe,称为:
丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。
一般氨基酸数目<12~20的肽为寡肽(小肽);>20的肽为多肽。
(二)肽的物理化学性质
(1)与氨基酸同,为离子晶格,熔点高,在水溶液中以偶极离子存在。
多肽中酰胺的氢不易解离,肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基和α-羧基,以及侧链R基上的可解离基团,如Glu的γ-COOH、Lys的ε-NH2。
(2)滴定曲线:
也有等电点,为多价离子等电点。
以Gly-Glu-Lys-Ala四肽为例(P166表4-6):
①当pH<3.5,末端可解离基团全部质子化,2个+NH3、2个COOH,净电荷+2;
②pH3.5-4.5,C-末端COOH解离(pKa=3.7),为2个+NH3、一个COOH、一个COO-,净电荷+1;
③pH4.5~7.5,Glu的γ-COOH解离,2个+NH3、2个COO-(pKa=4.6),为等电点,净电荷为0;
④pH7.8~10.2,N末端-+NH3解离(pKa=7.8),一个+NH3、一个NH2、2个COO-、净电荷-1;
⑤pH>10.2,ε-+NH3解离,2个NH2、2个COO-,净电荷-2。
pH在等电点以上(碱性),多肽带负电荷。
pH在等电点以下(酸性),多肽带正电荷。
蛋白质滴定曲线更加复杂。
(3)化学反应
①与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色,为α-NH2反应(注意:
伯胺也可使茚三酮显紫色),氨基酸、多肽均有此反应。
Pro为仲胺(亚氨基氨基酸),与茚三酮生成黄色物质。
茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。
②肽键的双缩脲反应:
多肽,蛋白质中有肽键,有此反应,氨基酸没有此反应。
双缩脲:
H2N-CO-NH-CO-NH2,P163。
双缩脲反应:
含有两个或两个以上肽键的化合物(如双缩脲或二肽以上等多肽)在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物,可定性或定量测定蛋白质含量,颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
(三)活性多肽:
动植物体内存在许多具有生理活性的多肽,多肽药物已获得人们的重视。
二肽:
肌肽β-Ala-His,抗氧化,抗自由基,消炎,调节免疫。
甜二肽AspartameAsp-Phe-OCH3,比蔗糖甜200倍。
三肽:
谷胱甘肽γ-Glu-Cys-Gly,维持红细胞及其蛋白质中Cys的-SH处于还原态。
四肽:
促胃酸激素。
五肽:
脑啡肽,内源性吗啡,与吗啡受体结合。
蛋氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheMet。
亮氨酸脑啡肽TyrGlyGlyPheLeu。
八肽:
α-鹅膏蕈碱,见P168图4-6,剧毒毒素。
九肽:
牛催产素,牛加压素(升高血压),见P167,两者只差两个氨基酸,但生理作用极不相同。
十肽:
短杆菌肽,见P532,为抗生素。
促黄体生成激素释放因子,见P551,为激素。
十六肽:
内啡肽,有镇痛作用。
二十四肽:
促皮质素(ACTH),治关节炎,已商品化。
二十六肽:
蜂素溶血肽,抗关节炎。
五十一肽:
胰岛素,降血糖。
以活性多肽研究为基础的药物研究:
血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(ACEI)的开发是近代高血压治疗史上
的重大进展。
人体内存在的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)为十肽,无活性,但在ACE作用下
转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为八肽,具有收缩血管平滑肌作用,使血压升高。
ACE
DRVYIHPFHL(AngⅠ)DRVYIHPF(AngⅡ)。
ACEI可使ACE失活,使AngⅠ不能形成AngⅡ,从而降血压,研究Ang
Ⅰ活性部位,作用机理,进而设计并合成ACEI,已开发出二十多种降压药物,
如巯甲丙脯酸(Captopril)、依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Lisonopril)等。
1.7蛋白质一级结构测定:
P168
测定蛋白质中共价键连接的全部情况,包括存在的链内、链间的二硫键位置,氨基酸数目、类型和顺序。
蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构,而三维结构决定其生物活性和功能。
蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的,是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。
蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史,具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。
如细胞色素C(P182),是一种含血红素的电子转运蛋白,存在于所有真核生物的线粒体中。
40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示,在细胞色素C中含有的一百多个氨基酸残基,其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的(P182图4-16),这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要,由此可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树(P183图4-17)。
来自任两个物种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。
(一)蛋白质测序
样品纯度应>97%,测分子量(允许误差10%)。
1.蛋白质分子中多肽链的数目:
测N-末端和C-末端残基的摩尔数。
寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。
2.每一多肽链氨基酸组成:
鉴定N-末端残基和C-末端残基,定出氨基酸序列参考点。
3.按专一方式断裂成较小的肽片段:
可用酶或化学方法完成,并用多种断裂方法,将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。
4.侧各肽段氨基酸序列:
常用Edman降解法,用自动序列分析仪。
5.测定片段次序:
用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。
6.确定二硫键位置。
(二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定
(1)N-末端分析
①二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法:
Sanger反应。
2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂,与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质,再酸性水解生成DNP-氨基酸(黄色),提取分离后可进行鉴定和定量测定。
此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。
②丹磺酰氯(DNS)法:
有荧光,灵敏度高。
5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯(DNS),结构式见170。
③Eman降解
苯异硫氰酸酯(PITC)法:
Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来,还可用来测定氨基酸序列。
PITC与多肽链每反应一次,得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。
PTH(phenylthiohydantoin):
苯乙内酰硫脲。
PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定,由此发展出氨基酸序列自动分析仪。
④氨肽酶法:
用外切酶,从N-末端逐个向里切。
最常用的是亮氨酸肽酶,适用于N-末端残基的氨基酸被封闭的肽(如环肽);N-末端是焦谷氨酸残基时,可使用焦谷氨酸氨肽酶。
(2)C-末端分析
①肼解法:
蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应,除C-末端氨基酸以游离形式存在外,其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。
肼进攻肽键而不易与-COOH反应,肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。
②还原法:
用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇,肽水解后可分离、鉴定。
③羧肽酶法:
专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸,P171图4-7。
(三)二硫键断裂:
用变性剂,如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性,分子内部-S-S-露出,并用HSCH2CH2OH处理,则-S-S-变成2个-SH,再用碘乙醇保护-SH不被氧化,P172图4-8。
也可用过甲酸氧化,将-S-S-变成2个磺酸基。
(四)氨基酸组成分析:
可用氨基酸分析仪进行测定。
样品可用酸完全水解(6mol/LHCl),再用碱水解测Trp。
测出Asx和Glx,酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。
P172表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。
(五)多肽链部分裂解成小肽段,分别测序:
现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段,需将蛋白质先裂解成较小肽段,分离后测序。
(1)酶裂解法:
常用的蛋白酶有以下几种(为内切酶):
胰蛋白酶:
水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键,如Lys,Arg。
糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶):
肽键羧基端为芳香族氨基酸,如Phe、Trp、或Tyr,以及疏水氨基酸Leu、Met或His。
胃蛋白酶:
特异性不太强,切点多,肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。
(2)化学裂解法:
溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键,反应见P175图4-10,生成肽酰高丝氨酸。
(六)肽段氨基酸序列测定
(1)Edman化学降解法:
每反应一次生成一个PTH-AA,层析分离、鉴定,剩下减少一个残基的肽链,又有新N-端参加下一轮反应。
由此进行氨基酸序列自动分析,进行几轮反应就能测出几个残基序列。
最低样品用量仅5pmol。
Edman降解现已有多种改进。
如DNS-Edman测序,可提高灵敏度;试剂的改进,用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。
(2)质谱法:
电喷射电离(ESI),见P178图4-11。
使蛋白质离子解吸进入气相,15肽以下均可用。
(七)肽段在多肽链中次序确定
用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段,由于切口错位,可由重迭肽(两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段)确定肽段先后次序,从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。
P179图4-12。
(八)二硫桥位置的确定
用切点多的胃蛋白酶水解肽链,生成比较小的含二硫桥的肽段混合物,将样品点在滤纸中央,在pH6.5进行第一向电泳分离。
然后用过甲酸蒸气熏,-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸(带负电荷)的肽。
将滤纸转900,在完全相同条件下再进行第二向电泳,大多数肽段迁移率未变,位于滤纸对角线上,而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线(向正极向),见P178图4-13。
将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推出二硫桥的位置(肽链内或肽链间)。
现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的,但仍需氨基酸序列分析配合。
§1.8蛋白质的三维结构P197第5章
蛋白质三维结构由氨基酸序列决定,且符合热力学能量最低要求,与溶剂和环境有关。
①主链基团之间形成氢键。
②暴露在溶剂中(水)的疏水基团最少。
③多肽链与环境水(必须水)形成氢键。
(一)研究蛋白质构象的方法
(1)X-射线衍射法:
是目前最明确揭示蛋白质大多数原子空间位置的方法,为研究蛋白质三维结构最主要的方法。
步骤为:
蛋白质分离、提纯→单晶培养→晶体学初步鉴定→衍生数据收集→结晶解析→结构精修→结构表达。
(2)其他方法:
NMR、紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、二维结晶三维重构。
(二)稳定蛋白质三维结构的作用力
(1)弱相互作用(或称非共价键,或次级键)
1.氢键2.疏水作用(熵效应)3.范德华力4.离子键(盐键)
(2)共价二硫键
(三)酰胺平面和二面角P205图5-11
(1)酰胺平面(肽平面):
肽键上的四个原子和相连的Cα1和Cα2所在的平面。
(2)两面角:
每个氨基酸有三个键参与多肽主链,一个肽键具有双键性质不易旋转,另两个键一个为Cα1与羰基形成的单键,可自由旋转,角度称为ψ,另一个为NH与Cα2形成的单键也可自由旋转,角度称为φ,ψ和φ称为二面角或构象角,原则上可取-1800~+1800之间任意值(实际受立体化学和热力学因素所限制),肽链构象可用两面角ψ和φ来描述,由ψ和φ值可确定多肽主链构象。
(四)二级结构P207
多肽链折叠的规则方式,是能量平衡和熵效应的结果。
主链折叠由氢键维持(主要),疏水基团在分子内,亲水基团在分子表面。
常见的二级结构元件:
α-螺旋,β-折叠片,β-转角和无规卷曲。
(1)α-helix:
蛋白质含量最丰富的二级结构。
肽链主链围绕中心轴盘绕成螺旋状紧密卷曲的棒状结构,称为α-螺旋。
1.两面角ψ和φ分别在-570和-470附近(φ:
从Cα向N看,顺时针旋转为正,逆时针为负;ψ:
从Cα向羰基看,顺时针为正,逆时针为负。
)
2.每圈螺旋含约3.6个氨基酸残基,由H键封闭的环中原子数为13,此种α-螺旋又称3.613-螺旋,每周螺距为0.54nm,R基均在螺旋外侧,P208图5-14。
3.α-螺旋本身是一个偶极矩,N-末端带部分正电荷,C-末端积累部分负电荷;α-螺旋几乎都是右手螺旋而有手性,并有旋光性,可用圆二色性(CD)光谱研究。
4.影响α-螺旋形成的因素:
R基小且不带电荷,易形成α-螺旋。
如PolyLys在PH7时,R基带正电荷,静电排斥,不易形成α-螺旋,但若PH=12,消除R基正电荷可形成α-螺旋。
PolyIle由于R基大,虽不带电也不易形成。
Pro由于无酰胺H,不能形成链内氢键,所以当Pro和羟脯氨酸存在时,α-螺旋中断,产生一个结节。
(2)β-折叠片:
第二种常见的二级结构
两条或多条相当伸展的多肽链侧向通过氢键形成的折叠片状结构,如P210图5-17。
肽链主链呈锯齿状,肽链长轴互相平行。
氢键:
在不同的肽链间或同一肽链的不同肽段间形成,氢键与肽链长轴接近垂直。
R基:
交替分布在片层平面两侧。
有两种类型:
平行结构(相邻肽链同向)和反平行结构(相邻肽链反向),见P210图5-18。
(3)β-
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物化学 第三 笔记
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)