凝胶色谱柱操作.doc
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凝胶色谱柱操作.doc
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凝胶色谱柱操作
1、溶胀
商品凝胶是枯燥的颗粒,通常以40~63um的使用最多。
凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天,如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸,则溶涨时间可以缩短到1~2小时。
凝胶的溶涨肯定要完全,否则会导致色谱柱的不均匀。
热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。
2、装柱
由于凝胶的别离是靠筛分作用,所以凝胶的填充要求很高,必需要使整个填充柱非常均匀,否则必须重填。
凝胶在装柱前,可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质,并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购置商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱,在柱的两端皆有平坦的筛网或筛板。
将柱垂直固定,参加少量流动相以排解柱中底端的气泡,在参加一些流动相于柱中约1/4的高度。
柱顶部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半,然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地参加已经脱气的凝胶悬浮液,同时翻开色谱柱的毛细管出口,维持适当的流速,凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积,直到所需高度位置。
最后撤除漏斗,用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的外表,再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查
凝胶色谱的别离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀,在对样品进行别离之前,对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯,用肉眼观察柱内是否有“纹路〞或气泡。
也可向色谱柱内参加有色大分子等,参加物质的分子量应在凝胶柱的别离范围,如果观察到柱内谱带窄、均匀、平坦,即说明色谱柱性能良好;如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样
凝胶柱装好后,肯定要对柱用流动相进行很好的平衡处理,才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素,总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平坦。
为了预防样品中的一些沉淀物污染色谱柱,一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些,但如果样品的溶化度与温度有关时,必须将样品适当稀释,并使样品温度与色谱柱的温度一致。
当一切都打算好后,这时可翻开色谱柱的活塞,让流动相与凝胶床刚好平行,关闭出口。
用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地参加到色谱柱中,翻开流出口,使样品液渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床外表平常,再次参加少量的洗脱剂冲洗管壁。
重复上述操作及此,每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床,又不致使凝胶床面枯燥而发生裂缝。
随后可渐渐地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。
整个过程肯定要认真,预防破坏凝胶柱的床层。
5、冲洗
凝胶色谱的流动相一半多采纳水或缓冲溶液,少数采纳水与一些极性有机溶剂的混合溶液,除此之外,还有个别比拟特别的流动相系统,这要根据溶液分子的性质来决定。
加完样品后,可将色谱床与洗脱液贮瓶及收集器相连,设置好一个适宜的流速,就可以定量地分布收集洗脱液。
然后根据溶质分子的性质选择光学、化学或生物学的方法进行定性和定量测定。
6、再生
因为在凝胶色谱中凝胶与溶质分子之间原则上不会发生任何作用,因此在一次别离后用流动相稍加平衡就可以进行下一次的色谱操作。
但在实际应用中常有肯定的污染物污染凝胶。
对已沉积于凝胶床外表的不溶物可把表层凝胶曲调,/LlNaCl溶液洗脱。
在通常情况下,一根凝胶柱可使用半年之久。
凝胶柱假设经屡次使用后,其色泽改变,流速降低,外表有污渍等就要对凝胶进行再生处理。
凝胶的再生是指用恰当的方法除去凝胶中的污染物,使其恢复其原来的性质。
交联葡萄糖凝胶厂用温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠和混合液浸泡,用水冲洗到中性;而对于聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶由于遇酸碱不稳定,则常用盐溶液浸泡,然后用水冲到中性。
7、保存
经常使用的凝胶以湿态保存为主,为了预防凝胶床染菌,可加少许氯仿、苯酚或硝基苯等化学物质,它可以使色谱柱放置几个月至一年。
凝胶的枯燥应先对凝胶进行浮选,除去细小的颗粒,并用大量水洗,除去盐和污染物,然后逐步增加一春浓度使凝胶收缩,在60~80度枯燥,在整个操作过程中的蒸馏水、器皿和房间必须干净。
琼脂糖凝胶的枯燥操作比拟麻烦,并且枯燥后还不简单溶张,所以一般仍以湿态保存为主。
凝胶色谱柱的使用方法
看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法,所以将自己的一点经验写下来,以作参考。
葡聚糖凝胶柱的使用方法大体有一下步骤:
(1)预处理称取葡聚糖凝胶〔有不同型号〕假设干克,参加洗脱剂〔通常为甲醇或者水,这里以甲醇为例〕约20倍凝胶量,置室温下3h进行溶胀,溶胀必须彻底,否则会使上柱后流速变慢,凝胶断裂等。
(2)装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:
15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝〔约200目尼龙布〕垫底或购置类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓慢连续装入,色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。
(1d为0.05ml,所以要1S两滴〕
胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱,等沉降到1-2cm时再2翻开色谱柱。
直至降到中意高度为止,等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时,用较小的滤纸盖住凝胶床外表,再用洗脱剂洗脱过夜。
装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹。
否则,必须到出重装。
(3)加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保存体积的洗脱剂平衡,待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平常〔不能流干,否则会带入气泡〕,用滴管吸取样品溶液,在高于凝胶外表约1cm处,沿管壁周围缓慢滴加样品液,加完后翻开下面的出口,使样品渗入凝胶内。
再关闭出口,用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下,再翻开出口,至溶液渗入柱内,再关闭出口。
可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以爱护柱外表〔我一般不加〕,然后即可进行洗脱。
(4)洗脱与收集洗脱时,用甲醇作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持肯定的液层,预防凝胶柱外表的液体流干。
一般酸性洗脱剂中碱性物质简单洗脱,碱性洗脱剂中酸性物质简单洗脱。
多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱,常用的洗脱剂是水-甲醇,水-乙醇,水-丙酮等,一般根据自己样品的性质选择洗脱液,洗脱液可一直用单一梯度。
凝胶色谱的共性是流速慢,每份一般体积较小。
〔内径1.3cm左右,长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml〕(5)凝胶的再生和回收凝胶柱屡次使用后,假设污染严峻,则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后,再用水洗净即可。
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