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细胞工程实验指导书

专业实验

实验指导书

李国平贾小丽张剑胡永乐编

生态与资源工程学院

2013年8月20日

目录

前言1

学生实验守则2

实验一MS培养基的配制3

实验二无菌操作及愈伤组织诱导技术9

实验三植物器官分化的调控11

实验四试管苗的驯化、移栽和管理13

实验五多倍体植株的诱导15

前言

生物工程是一门实践性较强的学科，在培养生物工程专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。

生物工程专业实验是生物工程专业教学实践的重要环节，是实现专业教学目标的重要载体。

通过专业实验，加强学生的专业理论基础，拓宽专业口径，培养学生综合运用不同学科领域的知识分析和解决实际问题的能力，为培养生物工程专业具有自主创新能力的高素质、应用型人才提供保障。

《专业实验》是为生物工程专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在生物化学实验、微生物实验、细胞生物学、分子生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。

生物工程专业实验内容覆盖了生物工程的上、中、下游的全过程，包括了基因工程、植物细胞工程、天然产物的提取与分离鉴定技术等，使学生得到生物技术实验操作的全程、全方面训练，以提高学生的学习兴趣、动手能力和工作的责任心。

由于生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物工程大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。

学生实验守则

一、自觉遵守纪律和各项规章制度，保持室内安静，注意环境卫生，不吸烟、不随地吐痰、不乱扔纸屑杂物，爱护公务。

二、实验过程中应严肃认真，严格遵守操作规程。

贵重、精密仪器的使用须在专人指导下进行。

三、爱护实验仪器设备，厉行节约。

仪器若有损坏，应如实报告，填写登记表。

凡损坏、丢失的仪器设备，均应查清原因，按仪器设备损坏、丢失赔偿制度处理。

四、实验物品不得随意翻动，严禁携出室外。

若需借用应办理借物手续。

五、注意实验室安全，易燃易爆品的操作应远离火源。

六、实验结束，由实验指导教师和管理人员检查清点仪器设备，学生应办好交接手续，做好清洁卫生，及时关好水电阀门，保持实验室和仪器的清洁整齐。

实验一MS培养基的配制

一、实验目的

使学生了解植物组织培养MS培养基母液种类及组成；掌握MS培养其母液浓度的换算、配制、保存和注意事项；掌握完全培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验做好准备。

二、实验原理

植物离体组织器官可在人工合成的培养基中生长分化。

用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐、糖类、其它有机化合物、生长调节剂，根据不同需要可添加其它附加成分。

植物组织培养中常用MS培养基。

培养基制备之前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。

当制备培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

已分装的培养基要经高压蒸汽灭菌，检验无菌后备用。

母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。

配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。

配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。

三、实验器具与药品

①器材：

电子天平、托盘天平、烧杯（50ml,100ml,500ml,1000ml）、量筒（1000ml,100ml,25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅。

②试剂：

配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备。

植物生长调节物质，2,4-D,NAA,6-BA等。

实验按每2个学生一组，每组分配制培养基母液及激素母液一套，50mL量筒、1000mL有刻度烧杯、吸球、电炉各1个，5mL移液管9支，50mL三角瓶20个。

四、实验内容与操作步骤

（一）MS培养基母液的配制

首先，按下表“MS培养基母液的配制”，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后，分别进行药品称取和母液配制。

母液种类

成分

规定用量ml/L

扩大

倍数

称取量mg

母液定容体积ml

配1LMS培养基吸取量ml

大量元素

KNO3

NH4NO3

MgSO4·7H2O

KH2PO4

CaCl2·2H2O

1900

1650

370

170

440

20

38000

33000

7400

3400

8800

1000

50

微量元素

MnSO4·4H2O

ZnSO4·7H2O

H3BO3

KI

Na2MoO4·2H2O

CuSO4·5H2O

CoCl2·6H2O

22.3

8.6

6.2

0.83

0.25

0.025

0.025

1000

22300

8600

6200

830

250

25

25

1000

1

铁盐

Na-EDTA

FeSO4·7H2O

37.3

27.8

100

3730

2780

1000

10

维生素和氨基酸

烟酸

甘氨酸

Vit.B1

Vit.B6

肌醇

0.5

2.0

0.1

0.5

100

100

25

100

5

25

5000

1000

10

1.MS大量元素母液的配制

按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。

配制时先用量筒量取蒸馏水800ml，放入1000ml的烧杯中，依次分别称取KNO338g;

NH4NO333g,MgSO4·7H2O7.4g,KH2PO43.4g,CaCl2·2H2O8.8g，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。

配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50ml。

2.MS微量元素母液的配制

将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大1000倍，用电子天平分别依次称取MnSO4·4H2O22.3g，ZnSO4·7H2O8.6g,H3BO36.2g，KI0.83g，Na2MoO4·2H2O0.25g，CuSO4·5H2O0.025g，CoCl2·6H2O0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000ml倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。

配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为1ml。

3.铁盐母液的配制

在电子天平上准确称量2.78g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和3.73g乙二胺四乙酸钠（Na-EDTA）,分别倒入盛有400ml蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。

将两种溶液倒入同一个1000ml的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000ml，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。

如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。

则会容易形成沉淀。

配制培养基时，每配制1000mlMS培养基吸取此母液10ml。

4.MS有机母液的配制

用电子天平依次称取：

肌醇（环己六醇）5000mg，盐酸硫胺素（维生素B1）5mg，烟酸25mg，甘氨酸100mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500ml的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。

配制培养基时，每配制1LMS培养基吸取该母液10ml。

5.植物生长物质母液的配制

⑴2,4-D母液：

准确称量2,4-D50mg，先用1~3ml90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至100ml，即配成浓度为500ml/L的母液。

贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存。

NAA母液的配制过程与2,4-D相同。

⑵6-BA母液：

准确称量50mg6-BA，加入少量碱溶液（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（1mol/L盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为500mg/L的6-BA的母液。

转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存备用。

5.注意事项

在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+，SO42-,PO43-等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。

（二）培养基的配制与灭菌

1.培养基的配方

本次实验，每组配制一种培养基，所配制的培养基配方如下：

A.愈伤组织诱导培养基：

MS＋2,4-D2mg/L（单位下同）

B.白花蛇舌草不定芽诱导培养基：

MS＋BA3+NAA0.2

以上培养基均添加蔗糖30g/L、琼脂7-10/L，pH5.8。

2.培养基的配制

1称取母液：

首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。

然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。

吸取量=需要配制培养基的体积×需要配制浓度/母液浓度

2培养基定容：

取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：

各母液移液管不能混用）。

倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L。

3调节pH值：

用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.8~6.0。

用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。

然后放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。

4分装：

将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约20~30ml，盖上盖子，贴上标签。

用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。

5培养基的灭菌：

把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。

3.培养基的灭菌：

利用高压灭菌锅的灭菌步骤，整个过程大概需要2个小时，按以下步骤操作：

①设定压力为0.11Mpa，温度为121℃

②三开（开出气阀、进水阀、外红阀）

③注水（开水龙头）至离进水显示柱高端1cm左右

④三关（关出气阀、进水阀、外红阀）

⑤打开电源开关，通电

⑥夹层压力在0.1Mpa以下可以将培养基和无菌水等需要灭菌的物品放入灭菌室⑦夹层压力达到0.1Mpa时打开夹层与灭菌室的开关

⑧夹层与灭菌室同事升温升压，如停止不升温可以手动打开放气阀再放气3~5分钟，待冷空气全部排净就可以升温升压，待达到0.1Mpa、121℃时，灭菌锅会自动保温不会继续升温与升压，这时开始计时15~20分钟，（培养基灭菌需要15~20分钟、无菌水需要20~30分钟）

⑨时间到，关闭电源，可以慢慢打开出气阀放气

⑩待温度与压力下降，80℃以下时可以将培养基与无菌水等移出灭菌锅备用。

4.实验结果：

一周后观察试验结果，描述培养基是否凝固及状态、颜色，如果实验失败（培养基不凝固）请分析原因，并自己找时间重新配置。

五、思考题：

1.培养基配置过程中应注意哪些因素？

培养基为什么要煮沸后再分装？

2.什么因素影响培养基的凝固？

灭菌锅的应用应该注意哪些方面？

实验二无菌操作及愈伤组织诱导技术

一、实验目的

通过实验，使学生了解外植体的选择和处理方法，初步掌握外植体材料的消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织的诱导方法。

二、实验原理

植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体植物器官或组织、甚至单个细胞的过程。

接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。

在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和保证。

经常使用的灭菌剂有酒精（70～75%）、次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴水和低浓度的氯化汞等。

使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。

但氯化汞灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必须将材料用无菌水多清洗几次。

消毒剂的种类不同，消毒灭菌的效果不同。

因此，选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、灭菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗干净或能自行分解的物质。

使用时需要考虑使用浓度和处理时间。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增值的无特定结构和功能的细胞团—愈伤组织，而植物生长调节剂2,4-D是诱导外植体形成愈伤组织的重要影响因素，本实验采用MS培养基添加2,4-D来诱导白花蛇舌草的愈伤组织。

三、实验器具与药品

①材料：

白花蛇舌草植株

②试剂及培养基：

0.1%HgCl2（剧毒！

小心使用）、75%乙醇、无菌水

愈伤组织诱导的培养基：

MS＋2,4-D2mg/L；MS＋BA3+NAA0.2

③器具：

超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔。

四、实验内容与操作步骤

1、接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。

用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种。

2、将外植体在自来水下冲洗干净，分别置于100ml烧杯中，用75%酒精浸泡30S后，移入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，然后在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将外植体切成0.5cm2的小块。

以上操作都要在酒精灯火焰旁进行。

3、在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将外植体接种在培养基中，每瓶接种3~4块，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。

4、将上述接种有外植体培养瓶置于实验室的培养室内进行培养。

并整理超净工作台台面。

五、实验结果及分析

1周后观察是否污染，2~3周后观察愈伤组织生长情况并进行简单讨论分析：

愈伤诱导率（愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数）、愈伤形态、大小、颜色、质地。

六、思考题：

在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌对接种工具、接种材料的污染？

实验三植物器官分化的调控

一、实验目的

观察和分析不同植物生长调节剂配比对器官分化的影响，掌握愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。

掌握离体培养中的器官发生调控技术。

二、实验原理

一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。

愈伤组织的分化包括细胞分化、组织分化和器官分化形成三个层次。

愈伤分化途径有两条：

不定芽途径与体细胞胚胎发生途径。

愈伤组织的分化方式与培养基中植物生长调节剂种类、浓度、比例有关。

另外，培养条件也对愈伤分化有较大影响。

三、实验器具与药品

①材料：

白花蛇舌草野生植株或以上试管无菌苗

②试剂：

0.1%HgCl2（剧毒！

小心使用）、75%乙醇、无菌水、新洁尔灭溶液

③器具：

超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔。

四、实验内容与操作步骤

1、实验前准备：

配制白花蛇舌草器官分化培养基。

培养基配方：

1.MS＋BA3mg/L（单位下同）

2.MS＋BA3+NAA0.1

3.MS＋BA3+NAA3

4.MS＋BA0.1+NAA3

5.MS+NAA3

以上培养基均附加30g/L的蔗糖，7~8g/L的琼脂，Ph5.8。

高压灭菌。

2、按照实验二相同的步骤，作好无菌操作准备。

3、取白花蛇舌草的嫩叶，经用少量洗衣粉洗刷后在自来水下冲洗1~2h，然后在超净工作台上用70%酒精消毒20s，再在0.1%升汞溶液加1~2滴吐温中灭菌10min，无菌水冲洗5~6次。

在超净工作台上按无菌操作的要求用长镊子将外植体接种到培养基上。

每瓶接种5片叶片，每种培养基接6-10瓶。

4、培养条件：

温度25±2℃，光照12h/d,光照强度为2000LX。

五、实验结果记录

本次实验操作过程、接种瓶数、每瓶接种量。

观察记载在不同培养基中外殖体的变化过程、外殖体是否形成愈伤组织，外殖体上是否有不定芽的形成、每外殖体形成芽苗的数量（繁殖系数）、芽苗的质量如何？

观察愈伤组织诱导和分化结果，统计外殖体在不同培养基中器官发生的差异，结合理论学习进行分析。

需要注意的是，愈伤组织的诱导和分化常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3－4周外殖体状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。

实验四试管苗的驯化、移栽和管理

一、实验目的

通过移栽操作，使学生掌握移栽基质的配制方法，试管苗的移栽技术及试管苗移栽后的管理技术。

二、实验原理

试管苗因其生活的试管内环境，其叶、茎上的角质层很薄，气孔调节能力弱，保水能力很差，根无吸收水分的能力。

移栽后，应注意保湿、保温、无菌、弱光等方面，使苗得到锻炼，逐渐适应外界环境。

‘

三、实验器具与药品

1．用具和材料：

解剖刀、镊子、乙醇灯、泥炭、珍珠岩、椰子壳粉、田园土等栽培基质。

2．材料：

待移栽的生根试管苗。

四、实验内容与操作步骤

1．将需要移栽的试管苗瓶盖打开，注入少量自来水，置于驯化室内练苗3～5d。

2．泥炭使用前，需进行灭菌，灭菌温度为60℃，30min。

然后把泥炭和珍珠岩按照1：

1（或其它基质）的比例进行配制，测量其pH，若pH较低，添加CaCO3调节pH至5～6*。

3．将基质填入穴盘，轻摇，用玻璃棒在每个穴孔中打1小孔。

4．将试管苗由培养瓶中取出，用清水洗掉苗上黏附的培养基。

将试管苗一个一个分开，在玻璃板上用解剖刀将苗上的变褐部位切掉，栽入穴盘中，轻压培养基质，使苗根与基质紧密接触。

5．用手持小型喷雾器，对移栽的试管苗喷施一些低毒杀菌剂。

6．将栽有试管苗的穴盘移入炼苗架上，盖上塑料薄膜进行炼苗。

7．移栽后的5～7d，每天对移栽的小苗进行少量喷雾，以保持足够的湿度。

然后逐渐降低湿度，可以采取每天将塑料薄膜揭开一小缝隙增加透风，降低湿度。

8．待苗移栽3周后，选择移栽成活的小苗移入营养钵内，置于一盆内，盆内加水，使水由营养钵底渗入。

*备注：

其它移植基质配比参照上述方法。

五、实验结果与分析

1．如何提高试管苗移栽成活率？

2．移栽后3周统计移栽的成活率，分析死亡的原因。

实验五多倍体植株的诱导

一、实验目的

1．了解人工诱导多倍体的原理，初步掌握用秋水仙素诱发植物多倍体植株的方法。

2．了解植物多倍体植株的鉴定方法。

二、实验原理

植物多倍体：

每个细胞中的染色体数具有3整套或更多套数的植物。

随着染色体组倍数的增加，有可能使一些作物的经济性状发生有利的变化。

因此，植物多倍体的研究和利用是育种工作中值得重视的途径之一。

人工诱导多倍体的方法很多，分为物理的（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等）和化学方法的（各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等）诱导方法。

其中，秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一。

秋水仙素是从百合科秋水仙属的一个种--秋水仙（Colchicumautumnale.L.）的器官和种子内提炼出来的一种植物碱。

它的化学分子式为C22H25O6N。

秋水仙素溶液的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体向两极的移动被阻止，而停留在分裂中期，但染色体的复制不受影响，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。

若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织。

由多倍性组织分化产生的性细胞，可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去。

如果将种子用秋水仙素浸渍，也可诱导多倍体植株产生。

鉴定多倍体可分直接鉴定和间接鉴定。

直接鉴定是将经过秋水仙素溶液处理的根尖、茎尖进行染色体计数，多倍体植株的染色体是加倍的。

间接鉴定是根据多倍体植株外部形态变化的主要特征是巨大性这一点提出的。

从外部形态上加倍后生长的植株比二倍体高大，叶片肥厚。

花粉粒和气孔的增大常作为染色体数目加倍的辅助性指标。

三、实验器具与药品

器材：

显微镜、培养箱、水浴锅（60℃水浴）、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、滴管，吸水纸。

材料：

洋葱、水稻、蚕豆、西瓜、玉米、萝卜、青菜、芹菜、芫荽等种子。

每实验组选择一种。

药品：

秋水仙素，1mol／LHCl溶液、改良苯酚品红溶液、95%酒精、冰醋酸。

四、实验内容与操作步骤

（一）秋水仙素溶液配制。

取秋水仙素1g（先用少量95%乙醇助溶），溶于250～500ml蒸馏水中，配成浓度为0.2～0.4%的溶液，冰箱中保存。

（二）种子的处理。

先将种子用0.1～0.2%升汞消毒10分钟，清水洗净，置于培养皿或沙盘中发芽。

用0.05%秋水仙素溶液分别浸种处理24、48、72小时，洗净秋水仙素，播种，观察形成的多倍体植株。

要求统计不同处理时间后种子的萌发率、根数、根长、根粗和苗高、茎宽；种植后统计成苗率和多倍体诱导率。

（三）幼苗的处理。

有些植物的种子耐药性差，可选择处理幼苗的方法。

由于秋水仙素只对分裂细胞发生作用，可处理茎尖、侧芽或顶端生长点。

如西瓜苗：

当西瓜幼苗子叶展平时，每日早晚用0.4%浓度的药液滴浸生长点各一次，每次一滴，连续四天。

以后长成的植株就是多倍体植株，得到种子后可进行染色体数目的鉴定。

（四）根尖染色体鉴定。

对多倍体植株，开花后注意采集种子；按常规使其萌发，当根长1cm时，取出洗净吸干，用0.2%秋水仙素溶液浸根处理24～36小时，根尖明显膨大时用固定液固定、制片、观察。

（五）观察气孔的大小。

取多倍体植物叶片，用尖头镊子夹住切口部分，撕下一薄层下表皮，放在载片的水滴里，铺平，盖上盖片，制成表皮装片，然后镜检比较四倍体与二倍体气孔和保卫细胞的大小，用测微尺测量并记录。

（六）观察比较花粉粒的大小。

从四倍体、二倍体植株上分别采集花粉，将采集到的花粉分别浸入45%冰醋酸中，用吸管分别各取一滴花粉粒悬浮液到载玻片上。

滴上碘化钾溶液，盖上盖片，制成花粉粒装片。

然后镜检四倍体及二倍体花粉粒的大小，用测微尺测量并记录。

五、实验结果与分析

3-4周后观察植株生长情况，做好实验记录，统计多倍体植株诱导率并做分析。