Oligo 设计教程.docx

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Oligo设计教程

Oligo设计教程

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：

1，  直接用键盘输入：

a，  点击file菜单中的NewSequence浮动命令，或直接点击工具栏中的NewSequence命令，进入序列展示窗口；

b，  此时即可键入DNA序列；

c，  如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。

点击Edit菜单中的“Readbackon”即可。

2，  利用复制和粘贴：

当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。

在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。

当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3，  如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一，普通引物对的搜索：

以Mouse4E（cDNA序列）为例。

我们的目的是以Mouse4E（2361bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。

1，点击“Search“菜单中的”ForPrimersandProbes“命令，进入引物搜索对话框；

2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatiblepairs。

在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：

a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。

3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。

①单击：

“searchRanges”按钮，弹出“SearchRanges”对话框。

输入上游引物的范围：

1－2000，下游引物的位置：

100－2300；PCR产物的长度600－800bp。

②单击“Paramaters”按钮进入“SearchParameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：

不同设定，参数以及更多参数。

③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。

④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Veryhigh/High等来完成对引物设计参数的设定。

⑤当我们选中“AutomaticallyChangeString”后，Oligo会在引物搜索过程中：

如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。

在设计反向PCR引物对时，就选中“InversePCR”复选框。

⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？

（PrimeEffitions，引发效率）。

也可以限定所选引物对的最大数目。

⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。

其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。

在“MoreParameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。

4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。

显示出得到的引物对数目。

5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。

单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。

6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。

另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。

一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。

点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。

7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。

例如点击“DuplexFormation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。

同理，“HairpinFormation”，“CompositionandTm”，“FalsePrimingSites”等命令就可以显示出相关信息。

所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。

需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120points以下。

8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：

首先点击“File”菜单中的“Print/SaveOptions”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“AnalyzeI”中选择需要保存的信息，在“AnalyzeII”中选中PCR。

单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“DataSaveas”，选择路径及文件名即可。

二，测序引物的设计：

在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。

还是以Mouse4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。

Open－Search

在“Search”窗口中，选中“SequecePrimer”，同时去除负链Search的选中

在“SearchRange”窗口，输入正链的600－800bp

在“Parameters”中选定veryhigh，引物长度改为18bp

结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。

三，探针的设计：

探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。

四，评估引物对：

我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。

这时就想到，是不是引物的质量有问题？

能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？

答案时肯定的。

1，点击File菜单中的New命令；

2，在“EditNewSequence”的窗口中用键盘输入上游引物；

3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；

4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；

5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；

6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；

7，从Edit菜单中选取“LowerPrimer”命令，在EditLower窗口中输入下游引物的序列；

8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；

9，选取“AcceptandQuit”命令；

如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。

10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。

用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。

在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligolength来改变。

定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。

引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。

③Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。

引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DeltaG值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。

Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。

④Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。

可以选择上游或者下游引物，同样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。

上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。

Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbormethod、％GCmethod和2（A＋T）＋4（G＋C）method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。

第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。

若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。

⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。

因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。

4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。