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液相色谱手性技术上
第一章绪论
1.1手性与生物活性
1.2手性分离的方法
第二章对映异构体
2.1引言
2.2分子结构和手性
2.3 手性分子的分类
2.4手性分子的命名
第三章 液相色谱基础
3.1基本概念简介
3.1.1柱效率N,H
3.1.2容量因子k’
3.1.3分离因子α
3.1.4分离度(RS)
3.2液相色谱仪
3.3检测方法
3.3.1液相色谱常用检测器
3.3.2旋光检测器
第四章 手性色谱拆分机理
4.1“三点相互作用”理论
4.2过渡金属配合物
4.3电荷转移作用
4.4包合作用
4.5温度效应
第五章刷型手性固定相
5.1引言
5.2刷型手性固定相的发展
5.3刷型手性固定相的类型
5.3.1—给体和—受体固定相
5.3.2氢键手性固定相
第六章纤维素手性固定相
6.1引言
6.1.1纤维素的一般性质
6.1.2纤维素衍生化
6.2 纤维素一三(苯甲酸酯)(CTB)手性固定相
6.2.1固定相的制备
6.2.2对映体分离
6.3纤维素-三(4-甲基苯基甲酸酯)(CTMB)手性固定相
6.3.1固定相的制备
6.3.2对映体拆分
6.4纤维素-三(苯基氨基甲酸酯)手性固定相
6.4.1固定相的制备
6.4.2 对映体拆分
6.5纤维素一三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相
6.5.1固定相的制备[65,75]
6.5.2对映体拆分
第七章淀粉手性固定相
7.1引言
7.2直链淀粉一三(苯基氨基甲酸酯)(ATPC)
7.2.1固定相的制备
7.2.2对映体拆分
7.3直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(ADMPC)固定相
7.3.1固定相的合成
7.3.2对映体拆分
7.4支链淀粉-三(苯基氨基甲酸酯)(APTPC)手性固定相
7.4.1固定相制备
7.4.2手性分离
7.5支链淀粉-三(苯基甲酸酯)(APTB)固定相
7.5.1固定相的制备
7.5.2对映体拆分
第八章环糊精手性固定相
8.1引言
8.2环糊精键合固定相
8.2.1键合方式
8.2.2β-环糊精键合相
8.2.3环糊精键合相的保留机理
8.2.4手性选择性
8.2.5流动相的选择
8.3多作用β-环糊精手性固定相
8.3.1多作用固定相的制备
8.3.2色谱特性
8.3.3流动相组成对保留和分离的影响
8.3.4.对映体选择性
8.3.5对映体分离
第九章大环抗生素手性固定相
9.1前言
9.2大环抗生素的结构和物理化学性质
9.2.1糖肽类
9.2.2安莎霉素类
9.2.3多肽与氨基糖苷类
9.3大环抗生素手性固定相的制备
9.4大环糖肽类抗生素手怀固定相的特性
9.4.1多模式手性固定相
9.4.2预测对映体选择性
9.4.3互补分离
9.5分离条件的选择
9.5.1流速、温度对映体分离的影响
9.5.2新极性有机模式的优化
9.5.3反相对映体分离条件的优化
9.5.4正相对映分离和优化
9.6大环抗生素手性固定相的对映拆分举例
第十章手性配体交换色谱
10.1引言
10.2手性配体交换色谱固定相
10.2.1手性配体交换色谱涂覆固定相
10.2.3以硅胶为载体的手性配体交换色谱键合固定相
10.2.4手性配体交换色谱流动相法
10.3手性配体交换色谱的手性识别机理
10.4手性配体交换色谱的影响因素
10.4.1手性选择剂的影响
10.4.2中心金属离子的影响
10.4.3温度的影响
10.4.4流动相pH值对分离的影响
10.4.5有机改性剂的影响
10.4.6介质的影响
第十一章 对映体制备分离
11.1引言
11.2分离模式
11.2.1迎头色谱法
11.2.2顶替色谱法
11.2.3冲洗色谱法
11.3色谱柱尺寸的选择
11.4制备分离常用的手性固定相
11.4.1固定相类型
11.4.2手性固定相的样品容量
11.5 流动相的选择
11.5.1流动相与保留时间和立体选择性
11.5.2流动相与手性样品的溶解性
11.6 不同类型手性化合物的制备分离
11.6.1手性药物对映体的制备分离
11.6.2农药和信息素
11.6.3手性合成纤维、手性助剂和手性固定相前体
11.6.4手性NMR溶剂
11.6.5机理研究的手性化合物
11.6.6手性杂原子化合物
11.6.6丙二烯和螺旋衍生物对映体
11.6.7阻旋手性化合物
11.6.8平面手性化合物对映体
11.6.9螺旋型或螺旋浆(推进器)型手性化合物
11.6.10金属茂
第十二章模拟移动床色谱手性分离
12.1引言
12.2模拟移动床色谱的分离原理
12.2.1真实移动床色谱的分离原理
12.2.2模拟移动床的原理
12.3操作条件
12.3.1步骤A:
获得相关的物理化学参数
12.3.2步骤B:
真实移动床的计算:
11.3.3步骤C:
模拟移动床的计算
12.4工艺设计举例
12.4.1采集物理化学参数
12.4.2模拟移动床:
线性条件
12.4.3模拟移动床非线性条件
12.5模拟移动床制备手性化合物的应用实例
12.5.1模拟移动床分离1-苯基-1-丙醇
12.5.2三种外消旋药物对映体的制备分离
第十三章化学剂的手性分离
13.1氨基酸及其衍生物对映体的分离
13.1.1氨基酸对映体的分离
13.1.2阿托α,α-双取代-β氨基酸对映体的分离
13.2二肽的手性分离
13.3半合成麦角碱对映体的分离
13.4环戊烯酮对映体的分离
13.5手性四面体金属簇合物的拆分
第十四章手性药物对映体的分离
14.1-受体阻滞剂药物类及其结构类似物的对映体分离
14.1.1在去甲万古霉素手性固定相上的分离
14.1.2在ChiracelOD柱上的分离
14.2多手性中心药对映体的分离
14.2.1两个手性中心药物对映体分离的例子
14.2.2多个(多于2个)立体中心药物对映体分离的例子
14.3人血和尿中双异丙吡胺及其代谢物单一N-脱烷基异丙吡胺对映体的分析
14.4多维高效液相色谱法测定人血中的潘托普拉咪唑对映体
14.5非手性-手性高效液相色谱测定尿中叔丁喘宁对映体
14.6固相萃取-HPLC法同时测定血浆中兰索咪唑对映体及其代谢物
14.7用半制备HPLC法制备阿苯达唑亚砜单一对映体
14.8液相色谱法分离和半制备雷喏嗪
第十五章手性农药对映体的分离
15.1五种手性有机氯农药和相关化合物的对映体的分离和半制备
15.1.1分析分离
15.1.2制备分离
15.2有机磷农药对映体的分离
15.2.1色谱柱和检测器
15.2.2色谱柱的选择
15.1.3流动相组成、流速、和柱温的优化
15.3手性三唑类农药对映体的分离
15.3.1分离条件选择
15.3.2最佳条件下的手性分离
15.4草和土壤中乙氧苯并呋喃磺酸酯除草剂的立体选择性降解
15.4.1样品的制备
15.4.2HPLC分离
15.4.3草坪草中的立体选择性降解
15.4.4土壤中的立体选择性降解
15.5用基质固相分散法和液相色谱法测定土壤中苯硫磷酸酯及其对映体比率
15.5.1样品预处理
15.5.2对映体分离
15.5.3土壤中苯硫磷酸酯对映体选择性降解的测定
第一节手性与生物活性
象手一样与其镜象不能迭合的分子叫手性分子(Chiralmolecules),手性分子和它的镜象互为异构体。
物体与其镜象不能迭合,这种现象叫做手性(Chirality,来自希腊语“Cheir”,意指手,它们象一双手)。
分子中含有不对称碳原子(相连有四个不相同的原子或基团),就可能有手性,这种化合物就可能有对映体。
手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。
生命现象中的化学过程都是在高度不对称的环境中进行的。
生物大分子如蛋白质、多糖、核酸等,全都有手征性。
除细菌等以外的蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成;多糖和核酸中的糖则是右旋的D-构型;在机体的代谢和调控过程中所涉及的物质,如酶和细胞表面的受体,一般也都具有手性,它们在生物体内造成手性环境。
正是因为这种立体化学的手性特征,使生命体系通常对药物,杀虫剂或味觉化合物中的一对对映体(光学异构体)表现出不同的生物反应。
表1.1列出了人们对一些萜烯和氨基酸对映体的味觉和嗅觉的反应[1—3]。
表中列出的大多数D-型氨基酸都具有甜味,L-型氨基酸或无味或味苦。
而谷氨酸的D-型却是苦味或无味,L-型的味道却鲜美。
手性药物进入生物体内后,其药理作用多与它和体内靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关。
因此含手性的药物,不同对映体显示出不同的药理作用和毒副作用。
已发现很多手性化合物的对映异构体具有不同的生理活性。
值得注意的是D-苯异丙胺是一种十分有效的中枢神经兴奋剂,而它的异构体则几乎没有药效,普萘洛尔(Proparnol,曾用名心安得)的L-异构体比D-异构体的生物活性高100倍。
有些手性药物的两种对映体有完全不同的药理作用,如曲托喹酚(tretoguinol,喘速宁)的S异构体是支气管扩张剂,R—异构体则有抑制血小板凝聚的作用。
有些对映体还会引起毒副作用,一个灾难性的例子是反应停(thalidomide,沙利度胺)(对映体结构见图1.1)的使用。
早在1960年用作镇静和安眠药,用于治疗妊娠期的不良反应。
但后来发现,怀孕早期的妇女服有此药会引起胎儿严重畸形,
表1.1某些氨基酸和萜烯对映体的味觉
萜烯
绝对构构型
气味
氨基酸
味觉/对映体
D-L-
香芹酮
R-(—)-
薄荷味
天冬酰胺
组氨酸
甜无味
甜无味
香芹酮
S-(+)-
蒿味
异亮氨酸
亮氨酸
甜苦
甜苦
苎烯
R-(+)-
橙汁味
色氨酸
酪氨酸
甜无味
甜苦
苎烯
S-(—)-
柠檬味
6-氯色氨酸
谷氨酸钠
甜无味
苦或无味鲜美
使该药停止使用。
1979年发现,仅R-(+)对映体沙利度胺具有镇静和安眠作用。
而S-(-)对映体对胎儿有致畸作用[4],而且这种对映体对镇静或安眠并不重要。
因此,如果单独服用(R)-(+)对映体,就不会产生致畸作用,这种药或许还可能继续使用。
表1.2列出了一些药物关学异构体的生理活性。
表1.2某些光学异构体化合物的生理活性
种类/名称
活性
药物
反应停(fhalidoide)
乙胺丁醇(ethambutol)
心得安(propranolol)
华法令(Warfarin)
丙异丙胺(amphetamine)
食物
天冬酰胺(asparagine)
香芹酮(carvone)
维生素
抗坏血酸(ascorbicacid)
(R)-(+)构型具有镇静安眠作用,(S)-(-)构型对婴儿有致畸作用
S,S-构性有抗结核菌作用,R,R-构型可导致失明
外消旋体用于药物,但只有(S)-(-)异构体有理想的肾上腺素
功能药物的活性
(S)-(-)异构体的抗血凝效果是(R)-(+)异构体的5倍
S-构型有抗炎作用,R-构型防治牙周病
D-构型是中枢神经兴奋剂,L-构型没有这种药效
D-构型为甜味,而L-构型为苦味
K-构型,薄荷味,S-构型,蒿味
(+)-异构体有好的抗坏血作用,而(-)-异构体则无这种作用
图1.1反应停的两种构型
手性化合物对映体生物活性的差别说明对药物,农业和食品及其它化学品测定对映体组成和纯度的重要性[2]。
目前,大约有60%以上的处方药分子中含有一个或多个不对称中心,而这类手性药物中的绝大部分是以外消旋的形式在市场销售[5]。
由于要得到两种光学纯的对映体十分困难,所以对许多对映体药物药理活性差别没有经过充分的研究。
这些药物中的一种对映体对病人可能无用或者甚至有害。
为了准确了解药效和安全用药,美国食品药品管理局(FDA)提出新的法规,要求申报手性药物时必须对不同异构体的生理作用叙述清楚[6]。
第二节手性分离的方法
通常由以下三种方法获得单一对映体的手性化合物:
1. 手性源合成法:
以单一对映体的手性化合物为原料合成另外手性化合物的单一对映体,这是化学家最常采用的方法。
但是由于天然手性物质的种类有限,使合成多种多样的目的产物受到很大的限制。
2. 不对称合成法:
在催化剂或酶的作用下,可得到过量的单一对映体手性化合物。
这种方法在近20年来得到很大的发展,有些反应已开始用于工业化生产。
但是要达到高旋光收率的反应(ee值大于90%),仍然有许多困难。
生物不对称合成具有很高的对映体选择性,但对底物的要求高,反应慢,产物分离困难。
3. 外消旋体拆分法:
这是一种在手性助剂的作用下将外消旋体化合物拆分为纯对映体化合物。
自从LouisPasteur于1848年报告了首例光学对映体分离以来,已分离了7000多种化合物。
主要用的是非对映盐的分级结晶法。
酶或微生物拆分法也已用于某些对映体,如氨基酸的制备分离。
据统计,大约有65%的非天然手性药物的纯对映体是由外消旋体或中间产物拆分得到的[7]。
外消旋体拆分的方法主要有:
(1)化学拆分法:
这种方法是先将对映异构体与纯手性物质形成非对映异构体。
然后利用
非对映异构体的性质差异进行分离(如分级结晶),再将衍生物还原为纯对映体。
这种古老的方法至今仍在使用,但操作周期长,适用的化合物也多限于酸碱类物质。
(2)酶或微生物法:
利用酶或微生物对对映体具有专一识别能力的性质,消耗掉一种对映体而得到另一种对映体。
(3)色谱拆分法:
与经典的对映体拆分法相比,色谱法具有许多明显的优越性,可以满足各种条件下对映体分离和测定的要求。
能够进行简便快速的定性定量分析,也能进行制备规模的分离和微量测定。
目前,色谱法已成为光学拆分最有用的方法。
这些方法包括高效液相色谱法[8—10]、气相色谱法[11]、薄层色谱法[12]、超临色谱法[13]、毛细管电泳[14]和逆流色谱—离心分配色谱法[15]。
表1.3列出了色谱法分离手性化合物的发展史[16]。
在这些色谱方法中,高效液相色谱法不会因高温而使溶质构型发生变化和失去生物活性,柱容量高,具有发展成实验和工业规模对映体制备分离的巨大潜力[17]。
液相色谱法手性拆分依据其原理可分为以下三种类型:
1.手性衍生化法:
利用待分离的两个对映体反应生成一对非对映体,然后在普通色谱柱(非手性柱)上实现分离。
该方法的优点是分离条件相对简单,只需采用普通HPLC的色谱分离条件即可,通过衍生化后,也有利于提高检测(紫外或荧光)灵敏度。
缺点是需要高纯度的衍生化试剂及各对映体衍生化的速率不同。
表1.3色谱手性分离的发展史
1939年
Henderson和Rule在乳糖上色谱分离外消旋樟脑衍生物
1952年
Dalgliesh:
提出氨基酸在纸色谱上光学分离的三点作用假设
1966年
Gil-Au等:
用GC直接分离对映体
1971年
Davankov和Rogozhin:
引入手性配体交换色谱
1972年
Wulff和Sarhan:
制备出手性LC的酶模拟聚合物
1973年
Hesse和Hagel:
制备出手性拆分的纤维素三乙酸酯
1973年
Stewart和Dherty:
把琼酯糖键合的牛血清清蛋白(BSA)用于手性拆分
1974年
Blaschke:
由光学活性单体合成出用手性LC的手性聚合物
1975年
Gram等:
用手性冠醚发展出主-客体色谱
1979年
Dirkle和House:
合成出第一个硅胶键合手性固定相,并应用于手性LC分离
1979年
Okamoto等:
合成出手性LC的螺旋形聚合物
1982年
Allenmark等:
把琼酯键合的BSA用于手性LC
1983年
Hermansson:
把硅胶键合的1-酸糖蛋白用于手性拆分
1984年
Armstrong和DeMond:
制备出硅胶键合环糊精固定相
2.手性流动相法将手性添加剂加入到流动相中,与溶质的对映体生成一对非对映络合物,在普通色谱柱上进行分离。
手性添加剂与溶质生成的络合物虽然不及衍生化法形成的衍生物牢固,但所依据的手性识别作用络合物的非对映异构体性质却基本相同。
常用的手性添加剂有:
环糊精,配体交换型添加剂等。
该方法的优点是无需进行柱前衍生,对色谱柱填料无特殊要求。
缺点是如添加剂选择不当会干扰溶质的检测,可拆分的化合物有限。
3.手性固定相法:
手性固定相法是基于样品与固定相表面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分离。
是不经过转变成非对映体的直接拆分的方法。
手性固定相拆分法的优点是制备方便,能适用于各类化合物的拆分。
缺点是目前还没有一种广谱性的色谱固定相,需根据样品的结构选择合适的手性柱。
尽管如此,手性固定相法仍是目前最具优势的光学异构体拆分方法,截至目前用这种方法已分离出几十类,上万种手性化合物的对映体,超出了过去近100多年分离出约7000种手性化合物对映异构体的总和。
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[12]R.Bushan,G.T.Thiongo,Biomed.Chromatogr.,1999,13:
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[14]S.Fandli,J.Chromatogr.,1996,735:
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[15]A.P.Foucault,L.Chevolot,J.Chromatogr.A1998,08:
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299-304
第三节对映异构体引言
立体化学(stereochemistry)由希腊词头 (stereos-)派生而来(意为立体)是从三维角度出发研究化学化合物额一门学科。
由于大多数分子是三维结构,立体化学对帮助我们了解它们结构的相互作用极为重要。
另外,三维图能够呈现出不能重叠的镜像。
例如,一只手的镜像不能与这只手重叠,这说明一种手性物体不能与它的镜像相互重叠。
图2.1为物体与其镜像不能重叠的例子
另一方面,有些物体,例如,没有衣袋的T-恤衫,它的镜像能够与重叠。
这种物体便是非手性。
因为它们有一个对称面(图2.2)。
分子也有类似的空间关系,因为分子能够呈现出对称或不对称图。
含有对称因素(对称面或对称轴或对称中心)的分子称为对称分子(symmetricmolecule),不含任何对称因素的分子称为不对称分子(asymmetricmolecule)。
正如手与其镜像的关系一样,不对称分子和它的镜像不能重叠,这种性质称为手性(chirality)含有不对称因素的手性分子的两种形式称为对映体(Enantiomer),这一名称来自希腊文Enantio(相反之意)。
图2.1不能重叠的物体[1]
图2.2非手性物体[1]
本章将对手性分子的结构和命名方法作一简要介绍。
有关这方面更为详细的介绍,可参考有关专著[2,3]
第四节对映异构体分子结构和手性
2.2.1含有不对称原子的化合物
我们知道碳原子具有正四面体的立体构型,而与碳原子结合的四个基团分别占据四面体的四个顶点。
若与碳原子相结合的四个原子或基团各不相同时,这个碳原子就称为手性中心(chiralcenter),该原子称为不对称碳原子。
含有不对称碳原子的化合物,它们的分子与镜相不能重叠。
具有这种关系的一对化合物称为“立体对映体”,简称为对映体。
例如乳酸分子的不对称碳原子与H、CH3、OH、COOH这四个互不相同的基团相结合,可能存在两个立体异构体(图2.3)。
一个碳原子所结合的四个基团中,如果有两个基团相同,即不会有旋光性化合物出现。
例如丙酸,与碳原子相结合的四个基团中,有两个是H,只可能存在一种立体异构体,不可能有任何另外的立体异构体。
如图2.4所示。
从丙酸的立体异构式可以看出,丙酸分子中含有一个对称平面,是一个对称的分子,这样的分子不具有旋光性。
或者说,丙酸分子与其镜像为同一物,可以完全相互重叠。
这样的分子是对称的,不具有旋光性。
除了碳原子外,硅,氮,磷和硫等元素与四个不相同基团相结合时,也会形成光学活性化合物,有一对立体对映体。
图2.3乳
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