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RTPCR实验方法总结大全.docx
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RTPCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验有三步:
抽提RNA,RT,PCR。
要求:
1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.RT按要求做,一般不会出太大问题。
3.PCR,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
必须
在RT时,引物设计有3种方法即a:
Random9mers;b:
OligodT-AdaptorPrimer;和c:
特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上),还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?
http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov
问题:
在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!
(注:
已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?
请高手指教!
解答:
1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。
(promega)。
2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
3.RACE
我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无
RT-PCR的常用内标b-actin和GAPDH的使用有选择性吗?
比如不同的细胞,不同的刺激。
有关内参:
RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。
问:
我曾经作过同一管的PCR,内有actin和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。
请教mxbdna2003,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?
答:
itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate<(forRTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch.buttheamountjustusing"accuratepiptte"iswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.
在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。
有关内参的建议:
一定要做内参的,每一次,我想。
不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC含量相似,或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。
我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp都是这样。
烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在***帖过。
关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR)、长度小于500bp-600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。
我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总RNA为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教。
我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖造成的,比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有没有人用过,告知其序列和genbank号。
正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完,当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)?
原位杂交最好用RNA做探针,效果好一些,反正你有钱卖roche的盒子,而且量也能保证,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果。
因此,我认为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:
做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的RT-PCR时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9mers随机引物),用我的引进物进行一般PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到,但足可以说明实验可以有自己的模式,书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制
请问:
1引物的特异退火温度怎样设定?
可以根据gc和at含量算出吗?
可以用引物报告单上的Tm值吗?
2PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适?
MgCl2应加多少?
各个成分的量有无确定标准?
3PCR结果跑电泳,actin有,但跑不出目的条带,有几种原因?
与cDNA的量少有关吗?
Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性?
一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指体积还是量?
只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.
如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:
有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯(DEPC):
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍:
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物:
由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):
从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5.其它:
SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。
这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。
此法利用mRNA3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1.3M醋酸钠(pH5.2)
2.0.1MNaOH
3.1×上样缓冲液:
20mMTris-HCl(pH7.6);0.5MNaCl;1MEDTA(pH8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。
配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA(pH8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:
10mMTris-HCl(pH7.6);1mMEDTA(pH8.0);0.05%SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
6.DEPC
二、操作步骤
1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。
3.使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.将RNA溶解于DEPCH2O中,在65℃中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。
当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。
5.将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。
6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。
前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。
后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30min。
9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀。
[注意:
此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。
4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。
10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。
三、注意事项
1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。
所以此步骤不能省略。
3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。
每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
RNA酶保护试验((RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。
与Northern杂交和RT-PCR比较,RPA有以下几个优点:
1.检测灵敏度比Northern杂交高。
由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失,使灵敏度下降,而RPA将所有杂交体系进行电泳,故损失小,提高了灵敏度。
2.由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降,而RPA没有扩增过程,因此,分析的数据真实性较高。
3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4.步骤较少,耗时短。
与Northern杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。
5.RNA-RNA杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。
6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。
7.检测分子长度可以任意设置,灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
一、试剂准备
1.GACUPOOL:
取100mMATP、CTP、GTP各2.78μl、100mMUTP0.06μl,加DEPCH2O至100μl。
2.杂交缓冲液IPES0.134g、0.5MEDTA(pH8.0)20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml,加DEPCH2O至10ml。
3.RNase消化液:
5MNaCl120μl、1MTris-HCl(pH7.4)20μl、0.5MEDTA(pH8.0)20μl、RNaseA(10mg/ml)8μl、RNaseT1(250U/μl)1μl,加DEPCH2O至2ml
二、操作步骤
1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。
(1)设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为:
5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。
PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度,具体设计时可考虑100-400bp长。
最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示:
上游引物
下游引物ⅡT7启动子序列
下游引物Ⅰ
(2)PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR,再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
(3)探针合成标记与纯化
在0.5ml离心管中加入下列试剂:
RNasin(40U/μl)0.5μl
GACUPOOLGAC
(含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61μM)2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl
DTT(二硫苏糖醇,0.1M)1μl
5×转录buffer2μl
模板(50ng/μl)1μl
T7RNA聚合酶(15U)1μl
混合后,短暂离心,37OC保温1hr。
加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl,37OC15min,然后75OC10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。
加入:
饱和酚50μl
氯仿50μl
酵母tRNA(2μg/μl)4μl
DEPCH2O100μl
室温下充分混匀,离心10000g×2min。
取上层液置另一0.5ml离心管中,加入100μl氯仿,混匀,离心10000g×2min。
将上层液转移至另一0.5ml离心管中,再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl,混匀后,-20OC静置30min。
4OC离心13500g×10min。
弃上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗涤,4OC离心13500g×2min,弃上清液。
室温下挥发残留乙醇。
加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀,4OC下保存待用。
可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。
(参见本节电泳步骤)。
2.杂交
(1)RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1μg/μl。
(2)取8μlRNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml离心管中。
(2)80OC保温2min,然后40-45OC下杂交12-18hr。
3.消化
(1)杂交管于37OC保温15min,加入RNase消化液,37OC保温30min。
(2)加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl,混匀,37OC保温10min。
(3)加入65μl饱和酚和65μl氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。
(4)转移上层液到另一0.5离心管中,加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl,再加入200μl异丙醇,混匀后,置-20OC30min,4OC离心,135000g×10min。
(5)弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
(1)配制凝胶:
(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:
1)6.25ml
5×TBE10ml
尿素24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl,TEMED50μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。
(2)预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达2000v以上,功率设定为100w,温度设为50OC。
待胶板温度达50OC时,暂停电泳,准备加样。
(3)加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80OC加热2min,立即加样到胶孔中,电泳1-2hr。
(电泳条件同预电泳)。
(3)电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片,盖上暗盒,-70OC曝光1-3天。
暴光结束后,将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1.本实验大部分为RNA操作,注意RNA酶的污染。
2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA,当探针与样品之间有碱基错配时,错配位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。
因此进行PCR时,采取尽量减少错配的措施。
3、同位素对RNA合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。
因此,标记时间不宜过长。
4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释10-100倍后使用。
可能问题出在标本的保存:
一般四小时之内就应处理,分离出细胞
说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了
第二次的引物设计要求可以低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl
二次PCR和巢式PCR,即设计两对引物进行扩增,不是一个概念,它是拿第一次的PCR产物,稀释100-1000倍做模板,加入底物,从新进行扩
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