TLC原理及应用.docx
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TLC原理及应用.docx
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TLC原理及应用
TLC原理及应用
吸附剂对不同物质吸附能力不同;展开剂对不同物质溶解度不同,通过展开达到分离的目的。
即混合液点在薄层板上时,吸附剂对不同物质有不同程度的吸附,在用溶剂展开时,因薄层上的毛细管效应,溶剂上升,当升到原点时,混合物溶解,溶解后随着不断上升的溶剂上移于原点之上,遇到新的吸附剂又被吸附,接着又溶解、解吸,使斑点不断上移。
而在上升过程中,由于有的成分吸附得牢些,即上移速度慢些,反之则快些,从而达到“差速迁移”,当展开至一定距离后,就可达到分离混合物的目的。
斑点上升的高度用Rf表示:
Rf=原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离,Rf≤1,展开剂极性越大,溶质Rf值越大(即爬的越高),但很可能降低分离能力;另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理,要使用多元溶剂体系。
薄层层析法具体操作注意事项
(一)铺板
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀:
过稠,板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀,水蒸发后,板表面较粗糙。
匀浆配比一般是硅胶G:
水=1:
2~3,硅胶G:
羧甲基纤维素钠水溶液=1:
2。
研磨匀浆的时间,根据经验来定,与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。
匀浆的稀稠除影响板的平滑外,也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。
涂层薄,点样易过载;涂层厚,显色不那么明显。
通常,板的质量对薄层鉴别的影响不是很大,影响最大是展开剂的配制和展开系统的饱和。
(二)点样
尽量用小的点样管。
如果有足够的耐性,最好只用1微升的点样管。
这样,点的斑点较小,展开的色谱图分离度好,颜色分明。
样品溶液的含水量越小越好,样品溶液含水量大,点样斑点扩散大。
样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。
点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。
(三)展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗,强烈振摇使混合液充分混匀,放置,如果分层,取用体积大的一层作为展开剂。
绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸,振摇展开缸来配制展开剂。
混合不均匀和没有分液的展开剂,会造成层析的完全失败。
各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求,尽量达到实验室仪器的最高精确度,比如:
取1ml的溶剂,应使用1ml的单标移液管,移液管应符合计量认证要求,尽管多数时候这不是必须的。
(四)展开系统的饱和
一般使用的是双槽的展开缸,一槽用来放展开剂,另一槽可加入氨水或硫酸。
把待展开的板放入两槽间的平台,斜架着,盖上展开缸的盖子。
让展开剂的蒸气充满展开缸,并使薄层板吸附蒸气达到饱和,防止边沿效应,饱和时间在半个小时左右。
展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中,不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大,当然动作应该尽量轻、快。
温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。
不冻结的前提下,通常温度越低分离越好,较难的分离需在低温下分离,例如人参皂苷。
湿度的影响,估计主要是影响薄层板的吸附能力,导致选择性(容量因子)的变化,湿度应根据实际情况确定。
温度控制使用空调器或冰柜,湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
TLC切记的要点
效应等等,使得判断不易。
利用TLC判断物质的纯度时,往往要和NMR相结合,因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。
但有趣的是,由于H1NMR可鉴别的纯度也就在95%左右,有时候H1NMR现示较纯的东西,一点板就会发现有几个点。
所以,两者要结合使用。
但是自己以前的样品,则可以只通过点板来判断纯度。
(四)纠正以下几个错误:
1、“由于层析柱和薄板的不同,即使两者使用的硅胶都相同,但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时,也显得极性偏大,所以要稀释一倍”,如果使用手工铺的TLC摸条件,则不必将洗脱剂的洗脱强度减小一倍,这种说法仅适用于使用预制高效板(HPTLC)的情况。
2、“对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质,在展开剂里往往加一点点三乙胺,氨水,吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。
当然,选择所添加的碱性物质,还必须考虑容易从产品中除去,氨水无疑是较好的选择”,这应区分是柱层还是TLC,对于柱层添加二乙胺比较好,对于分析TLC添加三乙胺或用氨水薰(不是加到展开剂里)都可以。
有机TLC板显色问题的讨论
专属性显色剂
由于化合物种类繁多,因此专属性显色剂也是很多的,现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下:
(1)烃类
①硝酸银/过氧化氢
检出物:
卤代烃类。
溶液:
硝酸银O.1g溶于水lml,加2-苯氧基乙醇lOOml,用丙酮稀释至200ml,再加30%过氧化氢1滴。
方法:
喷后置未过滤的紫外光下照射;
结果:
斑点呈暗黑色。
②荧光素/溴
检出物:
不饱和烃。
溶液:
I.荧光素0.1g溶于乙醇lOOml;
Ⅱ.5%溴的四氯化碳溶液。
方法:
先喷(I),然后置含溴蒸气容器内,荧光素转变为四溴荧光素(曙红),荧光消失,不饱和烃斑点由于溴的加成,阻止生成曙红而保留荧光,多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色。
③四氯邻苯二甲酸酐
检出物:
芳香烃。
溶液:
2%四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10:
1)的溶液。
方法:
喷后置紫外光下观察。
④甲醛/硫酸
检出物:
多环芳烃。
溶液:
37%甲醛溶液O.2ml溶于浓硫酸l0ml。
(2)醇类
①3,5一二硝基苯酰氯
检出物:
醇类。
溶液:
I.2%本品甲苯溶液;
Ⅱ.0.5%氢氧化钠溶液;
Ⅲ.O.002%罗丹明溶液。
方法:
先喷(I),在空气中干燥过夜,用蒸气薰2min,将纸或薄层通过试液(Ⅱ)30s,喷水洗,趁湿通过(Ⅲ)15s,空气干燥,紫外灯下观察。
②硝酸铈铵
检出物:
醇类。
溶液:
I.1%硝酸铈铵的0.2mol/L硝酸溶液;
Ⅱ.N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于甲醇、水与乙酸(128m1+25m1+1.5m1)混合液中,用前将(I)与(Ⅱ)等量混合。
喷板后于105oC加热5min。
③香草醛/硫酸
检出物:
高级醇、酚、甾类及精油。
溶液:
香草醛1g溶于硫酸lOOml。
方法:
喷后于120oC加热至呈色最深。
④二苯基苦基偕肼’
检出物:
醇类、萜烯、羰基、酯与醚类。
溶液:
本品15mg溶于氯仿25ml中。
方法:
喷后于110oC加热5~lOmin。
结果:
紫色背景呈黄色斑点。
(3)醛酮类
①品红/亚硫酸
检出物:
醛基化合物。
溶液:
I.0.01%品红溶液,通入二氧化硫直至无色;
Ⅱ.0.05mol/L氯化汞溶液;
Ⅲ.O.05mol/L硫酸溶液。
方法:
将I、Ⅱ、Ⅲ以1:
1:
10混合,用水稀释至l00ml。
②邻联茴香胺
检出物:
醛类、酮类。
溶液:
本品乙酸饱和溶液。
③2,4-二硝基苯肼
检出物:
醛基、酮基及酮糖。
溶液:
I.0.4%本品的2mol/L盐酸溶液;
Ⅱ.本品O.1g溶于乙醇l00ml中,加浓盐酸lml。
方法:
喷溶液I或Ⅱ后,立即喷铁氰化钾的2mol/L盐酸溶液。
结果:
饱和酮立即呈蓝色;饱和醛反应慢,呈橄榄绿色;不饱和羰基化合物不显色。
④绕丹宁
检出物:
类胡萝卜素醛类。
溶液:
I.1%~5%绕丹宁乙醇溶液;
Ⅱ.25%氢氧化铵或27%氢氧化钠溶液。
方法:
先喷溶液I,再喷溶液Ⅱ,干燥。
(4)有机酸类
①溴甲酚绿
检出物:
有机酸类。
溶液:
溴甲酚绿0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml。
方法:
浸板。
结果:
蓝色背景产生黄色斑点。
②高锰酸钾/硫酸
检出物:
脂肪酸衍生物。
溶液:
见通用显色剂酸性高锰酸钾。
③过氧化氢
检出物:
芳香酸。
溶液:
0.3%过氧化氢溶液。
方法:
喷后置紫外光(365nm)下观察。
结果:
呈强蓝色荧光。
④2,6-二氯苯酚-靛酚钠
检出物:
有机酸与酮酸。
溶液:
0.1%本品的乙醇溶液。
方法:
喷后微温。
结果:
蓝色背景呈红色。
(5)酚类
①Emerson试剂(4-氨基安替比林/铁氰化钾(Ⅲ))
检出物:
酚类、芳香胺类及挥发油。
溶液:
I.4-氨基安替比林1g溶于乙醇100ml;
Ⅱ.铁氰化钾(Ⅲ)4g溶于水50ml,用乙醇稀释至100ml。
方法:
先喷溶液I,在热空气中干燥5min,再喷溶液Ⅱ,再于热空气中干燥5min,然后将板置含有氨蒸气(25%氨溶液)的密闭容器中。
结果:
斑点呈橙-淡红色。
挥发油在亮黄色背景下呈红色斑点。
②Boute反应
检出物:
酚类、氯、溴、烷基代酚。
方法:
将薄层置有NO2蒸气(含浓硝酸)的容器中3~10min,再用NH2蒸气(浓氨液)处理。
③氯醌(四氯代对苯醌)
检出物:
酚类。
溶液:
1%本品的甲苯溶液。
④DDQ(二氯二氰基苯醌)试剂
检出物:
酚类。
溶液:
2%本品的甲苯溶液。
⑤TCNE(四氰基乙烯)试剂
检出物:
酚类、芳香碳氢化物、杂环类、芳香胺类。
溶液:
0.5%~1%本品的甲苯溶液。
⑥Gibb’s(2,6-二溴苯醌氯亚胺)试剂
检出物:
酚类。
溶液:
2%本品的甲醇溶液。
⑦氯化铁
检出物:
酚类、羟酰胺酸。
溶液:
1%~5%氯化铁的0.5mol/L盐酸溶液。
结果:
酚类呈蓝色、羟酰胺酸呈红色。
(6)含氮化合物
①FCNP(硝普钠/铁氰化物)试剂
检出物:
脂 肪族含氮化物,如氨基氰、胍、脲与硫脲及其衍生物,肌酸及肌酐。
溶液:
10%氢氧化钠溶液、10%硝普钠溶液、10%铁氰化钾溶液与水按1:
1:
1:
3混合,在室温至少放置20min,冰箱保存数周,用前将混合液与丙酮等体积混合。
②Dragendorff(碘化铋钾试剂)试剂
检出物:
芳香族含氮化合物,如生物碱类、抗心律不齐药物。
溶液:
I.碱式硝酸铋0.85g溶于10ml冰醋酸及40ml水中;
Ⅱ.碘化钾8g溶于水20ml中。
.
将上述溶液I及Ⅱ等量混合,置棕色瓶中作为储备液,用前取储备液lml、冰醋酸2ml与水l0ml混合。
结果:
呈橘红色斑点。
③4-甲基伞形酮
检出物:
含氮杂环化合物。
溶液:
本品0.02g溶于乙醇35ml,加水至100ml。
方法:
喷板后置25%氨水蒸气的容器中,取出后于紫外灯(365nm)下观察。
④碘铂酸钾
检出物:
生物碱类及有机含氮化物。
溶液:
10%六氯铂酸溶液3ml与水97ml混合,加6%碘化钾溶液,混匀。
临用前配制。
⑤硫酸高铈铵/硫酸
检出物:
生物碱及含碘有机化物。
溶液:
硫酸铈1g混悬于4ml水中,加三氯乙酸1g,煮沸,逐滴加入浓硫酸直至混浊消失。
方法:
喷后薄层于1l0oC加热数分钟。
结果:
阿朴吗啡、马钱子碱、秋水仙碱、罂粟碱、毒扁豆碱与有机碘化物均能检出。
⑥Ehrlich(对二甲氨基苯甲醛/盐酸)试剂
检出物:
吲哚衍生物及胺类。
溶液:
1%本品的浓盐酸溶液与甲醇按1:
1混合。
方法:
喷后板于50oC加热20min。
结果:
呈不同颜色的斑点。
(7)胺类
①硝酸/乙醇
检出物:
脂肪族胺类。
溶液:
50滴65%硝酸于乙醇100ml中。
方法:
需要时120oC加热。
②2,6-二氯醌氯亚胺
检出物:
抗氧剂、酰胺(辣椒素)、伯、仲脂肪胺、仲、叔芳香胺、芳香碳氢化物、药物、苯氧基乙酸除草剂等。
溶液:
新鲜制备的0.5%~2%本品乙醇溶液。
方法:
喷后薄层于110oC加热10min,再用氨蒸气处理。
③茜素
检出物:
胺类。
溶液:
O.1%本品的乙醇溶液。
④丁二酮单肟/氯化镍
检出物:
胺类。
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