糖化酶研究进展.docx
- 文档编号:30556261
- 上传时间:2023-08-16
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:24.98KB
糖化酶研究进展.docx
《糖化酶研究进展.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《糖化酶研究进展.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
糖化酶研究进展
酶学
糖化酶的研究进展
2013年
糖化酶的研究进展
摘要:
糖化酶是世界上生产量最大和应用X围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。
本文从微观学角度出发,主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制;另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用;最后提出了研究中存在的问题以及解决办法,并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。
关键词:
糖化酶;结构;催化机制;分离纯化;功能
STUDYINGSTRUCTUREANDFUNCTIONOFGLUCOAMYLASE
Abstract:
Glucoamylaseistheenzymewhichhasthemostoutputandthevastestapplicationintheworld.Fromtheperspectiveofmicroscopicscience,Thisreviewintroducesthestructureandcatalyticmechanismofglucoamylase;additionallyintroducedseparationandpurificationmethodsandapplicationofglucoamylase;Intheend,putforwardtheapplication,theproblemsandsolutionsofglucoamylaseresearch,providefutureapplicationprospect.
Keywords:
glucoamylase;structure;Catalyticmechanism;Purification;function
糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-(1-4)-葡聚糖—葡萄糖水解酶,它的底物是葡萄糖分子通过α-(1-4)-糖苷键连成的高分子,水解产物是葡萄糖,酶学编号是E3.2.1.3[1]。
糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类,早在1500年前,我国已用糖化曲酿酒,本世纪20年代法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲,并用于酒精生产。
目前,糖化酶已涉及到食品、医学、发酵等多个行业,具有广泛的应用价值。
1.糖化酶的结构及其催化机制
1.1糖化酶的结构
糖化酶是由微生物分泌产生的,具有外切酶活性的胞外酶,催化淀粉从非还原端水解α-1,4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。
它是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,分子量在60000~1000000间,含有一个催化域(CD)和一个淀粉结合域(SBD),两者之间通过O-糖基化连接域(L)连接起来[2]。
糖化酶的N末端催化区域通过(α/α)6形成一个漏斗状活性中心,经高度糖基化的O-糖基化连接域与C末端通过β反平行折叠形成的两个淀粉亲和区相连接,在空间上具有相对紧密、稳定活性功能。
糖化酶催化域(CD)含有400多个氨基酸残基,富含Ser和Ala两种氨基酸,其中ser443和ser444之间热稳定性较差,易断裂。
来自不同真菌的糖化酶的催化域的二级结构有所差异。
泡盛曲霉X100的糖化酶CD中含有13股α一螺旋,除α一螺旋11外均参与折叠成“桶”状(α/α)6结构,黑曲霉及子囊菌酵母糖化酶CD的构型与泡盛曲霉X100的CD构型基本相似,但子囊菌酵母CD含有14股α一螺旋,其中的12股α一螺旋形成与泡盛曲霉、黑曲霉CD结构类似。
Sauer等人认为黑曲霉糖化酶水解α一1,4--糖苷键的机制是典型的酸碱催化,Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体,Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上,形成含氧碳正离子,在Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂,同时使水解产生的α—D(+)-葡萄糖异构化生成β一D(+)构型[3]。
淀粉结合域(SBD)的结构中,根据SBDs氨基酸序列的同源性,SBDs被划分为6族,分别为CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41,黑曲霉和米根霉分泌的糖化酶分别属于CBM20和CBM21。
来源于黑曲霉的糖化酶(AnGA)的SBD位于AnGA的C一末端,
而来源于米根霉的糖化酶(RoGA)不仅C一末端含有一个SBD.且N一末端也含有一个SBD。
AnGACBM20和RoGACBM21约含100个氨基酸,其中富含苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)等芳香族氨基酸残基,不含半胱氨酸(Cys)。
AnGACBM20和RuGACBM21两者之间的氨基酸序列差异很大,同源性仅为13.5%,但芳香族氨基酸的同源性较高,主要为色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
虽然两者氨基酸序列同源性很低,但其二级结构和三级结构却惊人的相似。
两者均不含α一螺旋结构,仅含β一折链和无规卷曲结构,由7~8段β一折叠链反平行折叠形成β一卷筒,β一卷筒再折叠形成2个β一折叠结构,两个底物亲和位点(Sl和SII)分别位于结构域的相向两侧。
SI和sⅡ中分别含有一个色氨酸(W)残基,AnGACBM20的SI含W590,SII含W563,Ro—GACBM21的SI含W70,SⅡ含W47;CBM表面分布着较丰富的酪氨酸残基(Y),RoGACBM21含有6个Y残基(Y32、Y58、Y67、Y83、Y93和Y94,AnGACBM20含2个Y残基Y527和Y556。
SBD不仅具有结合淀粉、多聚糖及寡聚糖等碳水化合物的功能还具有协同催化域水解底物的生物活性。
AnGACBM20和RoGACBM21的SI、SⅡ都能结合淀粉颗粒,但两者对底物的亲和性差异较大,sⅡ亲和力(Kd=6.4µM)远大于SI(Kd=28µM)。
SI主要是在催化反应起始阶段识别底物,它只能识别可溶性长链多聚糖,同时还具有促进SⅡ对底物的亲和作用;SⅡ则引起底物的构像改变,以淀粉类似物β一环糊精(BCD)为底物,发现β-CD的非极性面结合到SBD的特定氨基酸的芳香环上。
正常情况下,淀粉颗粒中的淀粉链之间是相互平行呈线性,而结合在SBD的2个位点上的2条淀粉链的方向几乎是相互垂直。
由此可以推断,SBD诱导淀粉链形成2个β转角,扭转了淀粉链的方向,使更多的底物向催化域中心靠近,产生底物‘定向效应’从而促进结合位点的亲和作用,提高酶的反应速率[4]。
O一糖基化连接域是一段约含70个氨基酸经高度糖基化的多肽链,糖质量分数约为70%,不同生物来源的糖化酶含O一糖基化连接域的比例不同,可变性较大。
该区域富含Ser和Thr残基,研究发现ser和Thr位点是寡聚糖O一糖基化的糖基化位点,且在生物活性条件下,甘露糖比半乳糖更容易以O一糖苷键连接到连接域的Ser和Thr残基上,平均每个Ser和Thr残基上连有5个甘露糖。
在糖化酶结构中,O一糖基连接域起连接催化域(CD)和淀粉结合域(SBD)的作用。
O一糖基连接域与低聚糖以共价键结合,对蛋白质骨架起到固定化作用,从而避免糖化酶被蛋白酶水解,而它本身不具有增强糖化酶亲和力的作用。
此外,该结构域还具增强糖化酶热稳定性的作用。
1.2糖化酶的催化机制
糖化酶催化域含有400多个氨基酸残基,富含Ser和Ala两种氨基酸,其中Ser443和Ser444之间热稳定性较差,易断裂。
Sauer等人研究了黑曲霉糖化酶,认为其催化水解α-1,4-糖苷键是典型的酸碱催化[3]。
Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体,Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上,形成含氧碳正离子,在Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂,同时使水解产生的α-D(+)-葡萄糖异构化生成β-D(+)构型。
糖化酶的底物具有特异性,糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构,同时也受到底物结构及大小的影响。
许多研究表明,碳链越长,亲和性越大。
它的最大反应速度随着碳链延长而增加,呈线形变化。
糖化酶主要作用于α-1,4糖苷键,对α-1,6和β-1,3糖苷键也具有活性作用。
管汉成等[5]对黑曲霉变异株T-21葡萄糖淀粉酶的底物特异性进行了研究,发现糖化酶GAⅠ仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,不能水解甘露糖、木聚糖、地衣多糖、右旋糖苷及α-,β-,γ-环状糊精,说明GAI对多糖中糖的组成及糖苷键具有较强的专一性。
2糖化酶的分离纯化研究史及工业化生产方法
2.1糖化酶分离纯化研究史
糖化酶的分离纯化是其进一步应用的基础,随着糖化酶的应用领域不断扩大和细化,开发筛选具有各种特性的糖化酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。
糖化酶的分离纯化主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离和萃取分离等方法。
X贺迎等人[6]研究了耐热糖化酶的分离纯化,通过细胞破碎、过滤、离心得到粗酶液,再将粗酶液用45%~80%硫酸铵分级沉淀,以去除部分色素和杂质蛋白。
沉淀先后用水、pH4.60.1mol/L的HAC-NaAC缓冲液透析平衡,上DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析。
再经过洗脱,收集对应于各洗脱峰的洗脱液得到了分离纯化后的耐热糖化酶,他们利用DEAE-Cellulose-52柱层析和制备电泳纯化得到了3个耐热糖化酶组分,并测定了3个耐热糖化酶的最适温度和分子量。
李彧娜、石XX等人[7]从Rhizopusmicrosporusvar.chinensisCICIMF0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,在分离纯化过程中,经过硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M阴离子层析、再经含0.100、200、300mmol/LNaCl的醋酸–醋酸钠缓冲液(pH6.0)梯度洗脱后,合并收集的活性组分,透析后冻干浓缩,冻干的酶粉用醋酸–醋酸钠缓冲液(pH6.0)复溶,在Bio-RadModel491PrepCell上进一步分离,可收集的到得纯化后的样品。
李彧娜、石XX等人在KW-802.5Shodex凝胶过滤柱(300mm×8mmI.D.)上测定表观相对分子质量,其相对分子质量约为52×103。
潘丽军,X志英等人[8]对米根霉葡萄糖淀粉酶进行了分离纯化,经硫酸铵盐析、透析脱盐、SephadexG-100柱层析等纯化步骤,葡萄糖淀粉酶比活力提高了23倍,,并用SDS-PAGE测得提纯后酶的相对分子量约为75.5kD。
此外,MicheleMichelin等人[9]用离子交换层析和sephadxG-100对宛氏拟青霉产生的糖化酶进行了分离纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出了其分子量为86.5kDa。
X峨等人[10]对黑曲霉胞外葡萄糖淀粉酶进行了纯化,经硫酸钱沉淀,sephadxG-25柱凝胶过滤脱盐等步骤,经PAGE鉴定纯化所得产品,并用SDS凝胶电泳测定了分子量。
2.2糖化酶的工业化生产
目前,国外糖化酶生产一般采用液体深层培养,发酵罐最大可达200m3,许多发达国家对温度、PH、溶解氧、搅拌功率的控制都实现了微机化。
我国生产的葡萄糖淀粉酶多数系由黑曲霉及其变异株经深层培养后提取而成[5]。
国内大多数厂家采用液体深层培养,发酵罐15~50m3,不锈钢制造,工艺控制点有温度、PH、罐压、空气流量等;许多厂家仍采用手控或仪表控制,个别厂家采用了微机控制。
液态深层发酵法的工艺流程为:
试管斜面种子→种子扩大培养→发酵→过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂。
此外,国内还有个别厂家生产糖化酶采用固体培养,其工艺流程为:
试管菌种→三角瓶款曲扩大培养→帘子曲种→通风制曲→成品。
3糖化酶的功能与应用
糖化酶是世界上生产量最大、应用X围最广的酶制剂。
糖化酶不仅用于酒类和酒精生产,还广泛地应用于葡萄糖、果葡糖浆、有机酸、味精等食品工业的多个领域[11]。
1972年联合国世界卫生组织和联合国粮农组织在日内瓦制定了‘旧内瓦议定书”。
1987年我国颁布了“食品添加剂糖化酶制剂”GB8276一87国家标准,目前糖化酶在工业生产中的应用非常广泛。
在传统白酒生产中,糖化是发酵的基础[12]。
我国传统白酒的生产一直沿用固态发酵法,大多使用淀粉质原料,一般以曲为糖化剂,成本高、产酒率低是一个普遍存在的问题,而使用糖化酶制剂代替曲,简化了生产工艺,提高了出酒率,降低了企业的生产成本,目前已被普遍采用并得到了快速的发展。
干啤酒是一种发酵度高的淡爽型啤酒,深受消费者欢迎,在干啤酒生产上利用糖化酶,使用多温度段糖化工艺,就可提高麦汁中可发酵性糖的比例,制成风味独特的干啤酒[13]。
将糖化酶应用于黄酒的生产,糖化率高,可以大大缩短发酵时间,从而可以降低成本,提高生产效率[14]。
在淀粉糖工业中,可以利用糖化酶水解淀粉的高度专一性,避免无机酸水解淀粉糖苷键的随机性,控制糖浆产品的糖分组成,从而提高产品纯度,克服酸水解时对生产设备的腐蚀。
糖化酶在天然产物提取中也有一定的作用[15]。
例如皂素在植物中大多以糖苷的形式存在,游离的甙元极少,为了提高皂素的收率,可以在酸水解之前先对黄姜原料进行酶解,这样既可以减少酸用量,又能明显地提高皂素的收获率与质量。
山药汁容易沉淀并有令人难以接受的臭味,针对这个问题有研究人员将山药干片先用水提取,然后再用酶水解,应用此工艺加工出来的山药汁,沉淀少、无臭味,并且酶用量少、酶解时间短。
在味精、柠檬酸等生产过程中,首先利用淀粉酶、糖化酶将其主要原料淀粉转化成低分子量糖类,再经发酵得到谷氨酸和柠檬酸。
此外,在烘焙行业,可以改善产品的风味品质[16]。
因此,糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值,受到了国内外学者的高度重视。
4.糖化酶的发展趋势
在糖化酶多型性的研究方面,由于糖化酶广泛地分布在微生物中,主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中,已有不少学者从事与糖化酶多型性的研究,如管汉成等人发现黑曲霉突变株T-21产生的葡萄糖淀粉酶具有多型性,分离纯化出能被生淀粉吸附和水解生淀粉的GA
和既不被生淀粉吸附又不水解生淀粉的GA
。
研究糖化酶多型性,开发糖化酶的新用途将成为糖化酶发展的一个方向。
在筛选高产菌株方面,目前,许多生产菌都是通过许多代人工选育出来的,对环境的适应能力、抵抗能力比较差。
而原生质体融合可以解决这一问题,因此利用微生物的原生质体融合技术是筛选高产糖化酶菌株的研究发展方向之一。
在育种方面,人工育种和代谢调节育种都具有很大的盲目性和运气成分。
利用基因工程能克服这些缺点,近来基因工程技术的发展,基因库的不断建立,人们利用基因工程手段,来选育糖化酶生产菌,也是糖化酶生产研究发展方向之一。
此外,糖化酶的固定化技术是糖化酶生产研究发展方向之一。
虽然国内外对糖化酶的固定化技术很多,但目前的固定化酶还存在着单位载体酶活量不高和不易保存的缺点,使其应用X围大受限制,因此继续发展糖化酶的固定化技术,努力提高单位载体的固定化酶活性容量,扩大其使用X围,也是糖化酶生产的发展方向之一。
应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力,利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株,提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等,进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面,诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因,将是一个重要方向,因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景。
5.启发与展望
由于糖化酶具有重要的应用价值,因此研究糖化酶的结构和作用机制非常重要,而分离纯化到得高产优良菌株是进一步应用的基础,也可见其重要性。
继续探索糖化酶结构与热稳定性、耐酸性之间的关系,进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制对糖化酶的使用具有促进作用。
我们发现一种酶,首先应该研究它的结构和催化作用机制,再看它的结构和功能之间存在的关系,弄清楚了它的结构和功能,就可以进一步探索其性质和用途,比如一种酶在某方面不具备该性质,我们可以想办法通过酶的改性来实现,这就是建立在弄清楚其结构的基础上的进一步研究。
目前,国内外越来越多的研究者正在将目光投向糖化酶的基础研究和工业应用中。
目前的研究热点,一方面是利用基因诱变DNA重组技术或其他生物学方法获得优良菌株,进一步提高糖化酶的活力;另一方面,通过诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因并转入受体菌进行表达与纯化。
这研究两大热点和糖化酶的实际应用紧密联系在一起,比如我们说的耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景。
总之,随着对糖化酶研究的深入我们会更好地利用它来造福于人类。
参考文献:
[1]金征宇,顾正彪等.碳水化合物化学[M]:
第一版,:
化工,2008.353
[2]朱文优,王新惠等.糖化酶的结构及催化机制的研究进展[J].酿酒,2009,36
(1):
21~23
[3]Sauer,J,Sigurskjold,B.W.Christensen,U.,Frandsen,T.P.Mirgorodskaya,E.Harrison,M.Roepstorff,P.andSvensson,B.Glucoamylase:
structure/functionrelationships,andproteinengineering[J].Biochim.Biophys.Acta,2000,1543:
75~293
[4]NathalieJuge,Marie-Fran_coiseLeGal—Co”effetl,CarolineS.M.FumissI,etc.ThestarchbindingdomainofglueoamylasefromAspergillusniger.overviewofitsstructure,function,androleinlaw—starchhydrolysis[J].BiologiaBratishva,2002,57(11):
239.
[5]管汉成,严自正,X树政.黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其一般性质[J].生物化学与生物物理学报,1993,25(5):
453~459
[6]X贺迎.耐热糖化酶的分离纯化及部分性质[J].食品研究与开发,2007,128(9)31~33
[7]李彧娜,石XX等.Rhizopusmicrosporusvar.chinensis生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质[J].应用与环境生物学报,2010,16(5):
717-718.
[8]潘丽军,X志英等.米根霉葡萄糖淀粉酶的分离纯化及特性研究[J].食品科学,2005,26(6):
27~30
[9]MicheleMichelin,PuriWcationandbiochemicalcharacterizationofathermostableextracellularglucoamylaseproducedbythethermotolerantfungusPaecilomycesvariotii[J].JIndMicrobiolBiotechnol,(2008),35:
17–25
[10]X峨,李聪.黑曲霉胞外葡萄糖淀粉酶的纯化及特性[J].XX大学学报(自然科学版)1996,18
(2):
149~154
[11]黎卫强.糖化酶在食品工业中的应用研究进展[J].沿海企业与科技,2010,(04):
64~66
[12]X兴照.谈谈传统白酒生产中糖化酶的应用[J].中国酿造,1998,(04):
27~29
[13]左永泉.应用箱化酶酿制干啤酒的技术研究[J].XX食品与发醉,1997,(04):
37~40
[14]王卫国.糖化酶在黄酒酿造中的应用探讨[J].XX师专学报,1996,13
(1):
43~45
[15]周雨丝.应用糖化酶改良法提取黄姜皂素[J].XX农业科学,2003,(05):
91~94
[16]JENNYLYNDA.JAMESandBYONGH.LEE.GLUCOAMYLASES:
MICROBIALSOURCES,INDUSTRIALAPPLICATIONSANDMOLECULARBIOLOGY-AREVIEW[J].JournalofFoodBiochemistry.2007
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 糖化酶 研究进展