基因工程课件总结.docx
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基因工程课件总结
基因工程要点:
按预先设计的蓝图,进行基因重组,导入受体细胞,产生新的性状
第一章
1、基因工程:
是在分子水平上进行的遗传操作,是指一种或多种生物体的基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们的愿望,进行严密的设计、经过体外加工重组,转移到另一种生物体的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
2、基因工程的三大要素:
供体、受体、载体
3、遗传工程与基因工程的关系:
广义的遗传工程包括细胞工程和基因工程;狭义的遗传工程就是基因工程。
一般所说的遗传工程多指基因工程,它们在具体内容上彼此相关,许多情况下混用。
4、基因工程形成的三大理论:
(1)证明了DNA是遗传物质
(2)揭示了DNA分子的双螺旋结构的模型和半保留复制的机理
(3)中心法则(遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定)
5、基因工程形成的三大技术
(1)限制性内切酶的发现与DNA的切割
(2)DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
(3)基因工程载体的研究与应用
6、基因工程的基本操作程序(切、接、转、增、检、分、PCR)
(1)从供体生物的基因组中分离获得带有目的基因的DNA片段
(2)限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分子切开
(3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上,形成DNA重组分子
(4)将重组DNA分子引入受体细胞
(5)带有重组体的细胞培养扩增,获得大量的细胞繁殖群体
(6)筛选和鉴定转化细胞,获得使外源基因高效稳定表达的基因工程细菌或细胞
(7)将选出的细胞克隆的目的基因进一步研究分析,并设法使之实现功能蛋白的表达
7、基因工程的研究内容:
基础研究、克隆载体研究、受体系统研究、目的基因的研究、生物基因组学研究、应用研究等。
8、1973年,被定为基因工程的诞生元年。
9、基因工程的应用:
(1)医药生产:
基因工程主要用于体内合成的极其重要的但量极少的肽类生产和疫苗的制作中,如:
用于治疗病毒感染和癌症的干扰素,乙肝疫苗等。
(2)基因诊断:
采用基因工程技术,就能用基因探针方便对异常基因结构进行分析。
如:
地中海贫血症;甲型血友病等。
(3)品种改良:
主要用于农业、畜牧业优良品种的培育和改良,以提高生物的抗病能力,农产品产量。
(4)基因治疗:
肿瘤疾病的治疗
(5)工业方面:
超级细菌快速分解石油;微生物生产氢。
第二章
1、宿主细胞的限制与修饰作用:
宿主细胞存在一个酶系统,这个系统能限制外来DNA的入侵,同时对自身DNA进行修饰保护。
来自A菌株的噬菌体不能侵染同种类的B菌株——限制
而来自A菌株的噬菌体侵染A菌株不受限制的现象称为修饰
限制与修饰是由菌株细胞的限制—修饰系统控制——宿主的限制与修饰现象
1.1在发现限制性内切酶工作中作出贡献的科学家W.Arber、H.Smith和D.Nathans荣获了1978年诺贝尔生物医学奖
1.2宿主控制的限制与修饰现象有两方面的作用:
一是保护自身DNA不受限制;二是破坏入侵的外源DNA,使之降解。
2、大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示,它有以下四种表型:
(1)野生型,具有完整的限制与修饰功能
(2)限制缺陷型,不能降解外源DNA,但具有修饰功能,这类突变株经常用于转化
(3)限制和修饰缺陷型,既无限制功能,又无修饰功能,也常用于转化实验
(4)修饰缺陷型,缺乏修饰自身DNA的功能,但具有限制功能,故也成为“自杀性表型”。
2.1、限制性内切酶的类型及其特性(课本22页表格)Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的特性
(1)2单:
酶为单一肽链,单一酶切特性,无其它功能
(2)2特:
酶在特定的序列,特定的位置进行特异性切割(特异识别,特异切割)
(3)2点:
酶作用需要Mg镁离子、缓冲液
4、限制性核酸内切酶:
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的限制性核酸内切酶,切断的双链DNA都具有5'磷酸基和3'羟基末端。
5限制酶特征:
1、限制酶识别靶序列同DNA的来源无关2、限制酶识别靶序列是惟一的
5.1已知大多数Ⅱ型限制型核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA,水解磷酸二酯键中3'位的酯键,产生3'端为羟基,5'端为磷酸基团的片段。
6、区分名词
回文结构:
双链DNA中含有的两个结构相同、方向相反地序列称为反向重复序列,也称同文结构。
粘性末端:
两条链上的断裂位置是交错的,但又是围绕着一个对称结构的中心,这两个突出末端都能在适当的温度下退火互补。
平末端:
在识别序列的对称轴上同时切割,形成平末端。
同裂酶:
来源不同能识别相同的序列,切割方式相同或不同;其中识别位点与切割均相同的酶。
同尾酶:
来源不同,识别序列也不同,但切割后能产生相同粘性末端的酶。
杂种位点:
由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
6.1Ⅱ型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割:
除双链DNA外,还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点,只是切割效率比较低。
6.2部分限制性核酸内切酶的识别序列:
BamHⅠ:
G↓GATCC;EcoRⅠ:
G↓AATTC;HindⅢ:
A↓AGCTT
KpnⅠ:
GGTAC↓C;PstⅠ:
CTGCA↓G;SacⅠ:
GAGCT↓C
7、一个单位的限制性核酸内切酶定义:
在合适的温度和缓冲液中,在50uL反应体系中1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。
8、星号活性:
限制性核酸内切酶的识别位点是在特定的消化条件下测定的,当条件改变时,有些酶的识别位点也随之改变,可能切割一些特异性识别序列类似的序列。
9、影响限制性核酸内切酶的活性的因素(从酶和底物两方面考虑)
酶(纯度、活性、用量、保护剂)底物(纯度、修饰、用量、保护剂)
(1)酶的纯度
(2)DNA的纯度(3)DNA甲基化的程度(甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性,同裂酶对甲基化的敏感性不同)(4)酶切反应的温度和时间(5)DNA分子的构型(6)限制性核酸内切酶的反应缓冲液(缓冲液的成分包括Tris-HCL、NaCl或KCl和Mg离子)甲基化酶对DNA起修饰作用,从而使自身DNA不受限制性核酸内切酶的切割
10、提高限制性核酸内切酶活性的方法:
(1)增加用量
(2)扩大酶反应体系(稀释)
(3)延长催化反应的保温时间(4)加入亚精胺提高酶的消化作用,保证合适的温度
11、诱发星号活性产生的常见原因有:
(1)高甘油含量
(2)内切酶用量过大(3)低离子强度(4)高PH(5)含有有机溶剂如乙醇(6)Mn离子、Cu离子、Zn离子、等非Mg离子的二价阳离子存在。
12、DNA连接酶常用的是T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶
DNA连接酶活性四要点
(1)切口
(2)ATP(3)适宜温度,一般为16℃(4)高浓度底物
切口要求:
(1)双链
(2)碱基完全配对(3)主链的磷酸二酯键断裂(4)主链断裂在5'-P,3'-OH
DNA连接酶催化的连接反应分为三步
(1)由ATP或(NAD)提供AMP,形成酶-AMP复合物,同时释放焦磷酸基团(PPi)或烟酰胺单核苷酸(NMN);
(2)激活的AMP结合在DNA链5'端的磷酸基团上,产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键;(3)与相邻的DNA链3'端羟基相连,形成磷酸二酯键,并释放出AMP。
13、DNA连接酶既能连接粘性末端又能连接平末端。
对粘性末端一般在12—16℃之间进行反应,以保证粘性末端退火及酶活性、反应速度之间的平衡。
平末端的连接反应可在室温(<30℃)进行,并且需要粘性末端连接大于10—100倍的酶量。
14、平末端如何连接
(1)加大酶浓度
(2)凝聚剂低浓度的PEG
平末端的连接方式:
(1)用T4DNA连接酶连接;
(2)用平末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA加上PolyA;(3)用Linker,adapter在DNA片段添加粘性末端;(4)PCR
15、DNA聚合酶作用的6个条件
(1)引物
(2)模板(3)底物(dNTP)(4)Mg离子(5)5'—3'方向(6)逐个添加碱基
16、当末端怎么也连接不上时,可用末端脱氧核苷酸转移酶(特点:
无需模板)
17、碱性磷酸酶与激酶都可以催化核酸分子的脱磷,使DNA或RNA的5'-P变成5'—OH末端
18、一个韦氏单位:
指37℃,20min内催化1nmol
从焦磷酸根置换到γ,β—
—ATP所需的酶量。
一个韦氏单位相当于0.2个M-L单位或者60个黏性末端连接单位。
根据DNA片段的分子大小及末端结构,在12-30℃下反应1-16h。
19、论述宿主控制的限制与修饰现象对宿主本身有何意义?
对基因工程研究有何意义?
(1)在不同大肠杆菌菌株(如K菌株和B菌株)上生长的入噬菌体(分别称为入、K和入、B)能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞K和B。
但它们分别于其宿主菌交叉混合培养时,则感染频率下降到原来的数分之一。
一旦入、K噬菌体在B菌株中感染成功后,由B菌株繁殖出来的噬菌体后代更能像入、B一样高频感染B菌株,但却不再感染它原来的宿主K菌株。
这种现象称为宿主细胞的限制与修饰作用。
(2)对宿主本身的意义:
①保护自身DNA不受限制②破坏入侵的外源DNA,使之降解。
(3)对基因工程的意义:
①提供工具酶②提供很好的受体
(4)结论:
宿主细胞存在一个酶系统,这个系统能限制外来DNA的入侵,同时对自身DNA进行修饰和保护。
1、5'—3'DNA聚合酶活性
2、5'—3'外切酶活性
3、3'—5'外切酶活性(校正功能)
逆转录酶:
RNA指导的DNA聚合酶,以mRNA为模板合成其互补DNA(cDNA).
碱性磷酸酶:
去磷酸基团作用,使DNA或RNA的5'—OH末端。
用途:
①5'末端标记②防止自身的连接。
末端转移酶:
在Mg离子作用下,将dNTP加到DNA分子的3'—OH不需要模板。
主要用途体给载体和外源DNA分别加上互补的同聚体尾巴,以便二者在体外连接。
DNA聚合酶:
能在引物和模板的存在下,把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3'—OH末端,催化核苷酸的聚合作用,合成方向对应于被合成链而言是从5'端到3'端,并且合成的产物与模板互补。
TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,需要Mg离子作辅助因子。
Klenow片段:
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可悲蛋白酶切割成两个小片段,一个较小的片段具有5'→3'外切酶活性,定位于酶分子的N末端;另一个较大的片段具有聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,称为Klenow片段或Klenow聚合酶。
Klenow聚合酶的主要用途是:
(1)补平经限制酶消化DNA所形成的3'凹陷末端,包括带裂口的双链DNA的修复;
(2)对带3'凹陷末端的DNA分子将进行末端标记(3)在cDNA克隆中,用于合成cDNA第二链;(4)用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA的序列分析(5)在单链模板上延伸寡核苷酸引物,以合成杂交探针和进行体外突变。
20、切口和裂口的区别
(1)切口(碱基不缺):
两个相邻核苷酸之间缺少一个磷酸二酯键的切口,可以用DNA连接酶连接起来
(2)裂口(碱基缺失):
缺少一个或几个核苷酸的裂口,DNA连接酶无法进行连接。
第三章、基因工程载体
1、载体:
指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具,它的本质是DNA复制子。
2、载体必须具备的3个基本条件
(1)能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制
(2)具有合适的限制性内切酶点(3)具有合适的选择标记基因,用来筛选重组体DNA。
3、基因工程根据来源和性质不同可分为:
质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。
根据功能和用途不同又可分为克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体、穿梭载体和多功能载体等。
根据受体细胞不同又可分为原核生物载体、真核生物载体、大肠杆菌载体、酵母载体、植物基因工程载体、动物基因工程载体等。
4、转化子与重组子的区别
转化子:
含有载体的受体细胞,但载体是空的
重组子:
载体含有目的基因的受体细胞
注:
重组子也是转化子
5、质粒DNA分子的特性cccDNA共价、闭合、环状DNA
质粒的一般生物学特性:
(1)是染色体外能自我复制的小型DNA分子
(2)大小从1Kb到200Kb以上不等(3)常携带编码某些酶类的基因(4)这些特性并非宿主细胞生命活动所必须的。
6、质粒复制的类型:
严紧型,松弛型有什么不同
质粒分为两种不同的复制类型:
严紧型和松弛型
(1)严紧型质粒在宿主细胞中拷贝数的复制受宿主细胞中染色体DNA复制的严格控制,二者紧密相关,因此质粒在宿主细胞中拷贝的数较少,一般只有1-3个拷贝。
(2)松弛型质粒的复制受到宿主的控制比较轻松,在宿主细胞中拷贝数较多,一般有10-200个拷贝,有时可达700个拷贝。
通常采用松弛型质粒作为基因工程载体
7、质粒的不亲和性:
指在没有选择压力的情况下,两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群,而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同的不亲和群。
8、质粒的转移性:
质粒的转移性是指从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
根据质粒是否写到控制细菌配对和质粒结合转移的基因,可以将其分为接合型和非接合型。
9、理想质粒载体的必备条件
(1)具有较小的分子质量和较高的拷贝数
(2)具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点
(3)具有两种以上的选择标记基因
(4)缺失mob基因
(5)插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
10、多克隆位点MCS:
是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。
11、MCS的作用:
它提供了各种各样的可单独或联合使用的克隆靶位点,以便克隆由多种限制性核酸内切酶中任意一种或几种酶切割后产生的DNA片段。
此外,插入到其中一个限制性核酸内切酶位点的片段,可在切点侧翼用适当的限制性核酸内切酶切割质粒而取出(回收)。
12、标记基因的种类与作用:
主要是抗生素类,如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素等,具有装载外源基因的作用,易于检测。
13、如何保障载体的安全性?
取出mob基因
14、如何识别图谱?
复制起点、酶切位点、选择标记基因
15、EcoRⅠ的活性:
指在一些特定的体外环境中,比如高盐或含锰离子的溶液中,EcoRⅠ的正常动力学特征受到了干扰,此时它不需要5'-GAATTC-3'这段完整的识别序列,而只需要其中的4个核苷酸即5'-AATT-3'核心序列,就能进行切割。
由这种切割所产生的EcoRⅠAATT粘性末端能够重新连接起来形成环状分子。
16、双酶切的目的:
保证目的基因插入载体的方向性(定向插入)
17只要是载体,就是克隆载体判断题
18、表达载体与克隆载体的区别与相同点
(1)都具备理想载体的要求(自我复制、酶切位点、标记基因)
(2)只要是载体,就是克隆载体
(3)克隆载体不一定是表达载体,因为克隆载体缺少与表达相关的元件。
(4)克隆载体用于基因或DNA片段无性繁殖,缺少与表达相关的元件。
表达载体专用于宿主细胞高水平表达外源蛋白质,其目的不是基因本身,而是编码的蛋白产物。
A与转录相关的元件-强启动子,一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录
B与翻译相关的元件-SD序列,在强启动子下游区与ATG上游区有一个好的核糖体结合位点序列,即SD序列,促进Pro翻译
C调控元件-终止序列,在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列,保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性
19、穿梭质粒载体:
指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记基因,因而可以再两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
20、表达载体:
是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。
表达载体的两套元件:
(1)形成RNA的元件:
增强子、启动子、起始位点、终止子
(2)与翻译有关的元件:
SD序列(原核);帽子结构(真核);5'—UTR(5'—非翻译区);起始密码子ATG;终止密码子;3'—UTR。
起始密码子和终止密码子中间的区域—开放阅读框
常用的质粒载体类型:
克隆质粒载体、表达质粒载体、多功能质粒载体、穿梭质粒载体
21、Ti质粒——与冠瘿瘤诱导有关
Ri质粒——与毛状根诱导有关
22、病毒载体的好处:
能主动受染特定细胞
23、启动子的类型:
(1)组成型启动子:
表达具有持续性;RNA和Pro表达量也是相对恒定的;它们不表现时空特异性,也不受外界因素的诱导(全表达)
(2)组织特异性启动子:
在这些启动子调控下,基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位,并往往表现出发育调节的特性,同时还有增强子和沉默子的一般特性。
(局部)
(3)诱导型启动子:
在某些特定的物理或化学信号的刺激下,可以大幅度的提高基因转录水平的启动子。
(选择表达)
24、选择标记:
为了有效的选择转化细胞,常用的选择标记大多数属于抗生素及除草剂抗性标记
25、投告基因:
是指用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因,常用的GFP。
26、什么叫α互补?
当无外源基因片段插入时,质粒表达α肽,它与宿主菌重F'因子的lacZ'△M15基因的产物互补,即α肽可与β-半乳糖苷酶的C端片段融为一体,形成具有酶学活性的β-半乳糖苷酶,产生lacZ+表型,实现了基因内互补,这种互补现象称为α互补。
27、蓝白斑筛选重组子的机理
(一)α互补
①β-半乳糖苷酶能水解β-半乳糖苷键
②β-半乳糖苷键被水解,在有道无IPTG存在时,在含有生色底物X-gal的平板上生成蓝色的菌落
③β-半乳糖苷酶被切成两段,N端小片段和C端大片段
④N端小片段α肽的序列放在载体上,编码C端大片段的序列放在受体细胞的染色体上
⑤编码α肽的序列放在载体上,编码C端大片段的序列放在受体细胞的染色体
⑥当载体进入受体细胞中,则α肽与C端大片段完成α互补,若此时有IPTG诱导,和X-gal存在,就形成蓝色菌落。
⑦α肽和C端大片段要置于强启动子之下,才能表达出来。
⑧将MCS插入载体,并不破坏α肽的功能
⑨并不是所有的受体细胞都能完成α互补,只能能合成C端大片段的受体细胞才能完成α互补。
(二)筛选平板筛选出转化子,但无外源基因存在
(三)插入外源基因MCS在α-肽编码区,当外源基因破坏了α肽时,则不能生成蓝斑,而生成白斑
(四)白斑是重组子
(五)蓝斑是没有外源基因的转化子
28、人工染色体:
酵母人工染色体(YAC)细菌人工染色体(BAC)
P1派生人工染色体(PAC)哺乳动物人工染色体(MAC)
29、入噬菌体载体:
噬菌体DNA进入细菌细胞内后,有两种生活周期:
裂解周期(溶菌周期)和溶原性周期。
入噬菌体基因组是一条线性双链DNA分子当入DNA进入细菌细胞后,便迅速通过粘性末端配对形成双链环状的DNA分子,这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点(可粘连末端)。
单链DNA噬菌体载体:
M13、f1和fd是一类关系十分密切的丝状大肠杆菌噬菌体。
它们的优越性:
(1)它们不存在包装限制问题,已成功包装了总长度为M13DNA6倍的DNA分子,能克隆较大的DNA片段。
(2)可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分子。
这种重组体单链DNA分子在基因定点突变、DNA序列测定、杂交探针制备中特别有用。
30、粘粒载体:
又称柯斯质粒载体,是一类含有入噬菌体的cos序列的质粒载体。
常用的粘粒载体有,pJB8,c2XB,pHC79,pcos1EBML,Pwe15,Pwe16。
31、一个理想的植物基因工程载体应是:
(1)分子质量不太大,插入较大的外源DNA片段而不影响其复制和转化细胞的能力。
(2)在受体细胞中多拷贝便于分离和纯化(3)能携带外源DNA进入植物细胞并整合到基因组中(4)具有标记基因,能有效的筛选转基因植株(5)对若干种限制性内切酶仅有一个切点。
32、表达载体构建的一般原则:
①阅读框架与外源基因高效表达②启动子与外源基因高效表达③转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达④有效的翻译起始与外源基因高效表达⑤终止密码子选择与外源基因高效表达⑥外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
33、植物表达载体启动子分为三类:
组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子
第四章、核酸操作的基本技术
1、核酸操作的4个步骤:
(1)获得细胞
(2)裂解释放(3)纯化分离(4)检测
2、影响核酸提取的因素:
(1)化学因素:
酸、碱、酶等
(2)物理因素:
高温、机械剪切等
3、核酸的提取方法:
(1)化学试剂提取法
①CTABA法(特点高盐可溶,低盐析出)
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液(0.7mol/LNaCl)中是可熔的;当降低溶液浓度到一定程度(0.3mol/LNaCl)时从溶液中析出。
②SDS法(高温低盐)利用高浓度的SDS(十二烷基磺酸钠)在较高温度(55-65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析、蛋白质变性,释放出核酸,然后采用提高盐溶液浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀(通常是加入5mol/L的乙酸钾于冰上保温,在低温条件下乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物)。
离心去除沉淀后,对上清液中的核酸进行反复抽提去除蛋白质,用乙醇沉淀水相中的核酸。
(2)离心分离法最常用的是氯化铯溶液做密度梯度介质
4、质粒的特点
(1)作为载体功能的特点①自我复制②酶切位点③选择标记
(2)本身结构上的特点:
cccDNA即共价、闭合、环状DNA
5、碱法提取质粒的原理
a在碱性PH下,DNA变性,恢复中性时,线性染色体DNA不能准确复性,与其它大分子共沉淀而质粒DNA可以准确复性。
b碱(一般是NaOH)协助破坏细胞壁和细胞膜,释放质粒DNA,还可以使DNA变性。
6、提取纯化核酸的三大步骤:
(1)细胞破碎
(2)除去与核酸结合的蛋白质及多糖、脂等杂质
(3)除去其它杂质核酸,获得均一的样品
7、碱法提取质粒中,主要化学试剂及作用
(1)NaOH:
使细胞破裂,释放质粒DNA,还可使DNA变性
(2)SDS(十二烷基磺酸钠):
破坏细胞,释放质粒DNA,使蛋白质变性,结合基因组DNA并除去
(3)一酸与乙酸钾混合物:
调PH,使变性质粒DNA快速复性
(4)75%乙醇:
把盐洗掉
(5)无水乙醇:
沉淀DNA
(6)平衡酚、氯仿、异戊醇:
去除上清液中残留蛋白
(7)TE:
保存DNA
溶液Ⅰ(水+TE):
分散细胞。
螯合金属离子,使金属酶失活
溶液Ⅱ(SDS+NaOH):
细胞壁肽聚糖碱性水解,核酸和蛋白质变性
溶液Ⅲ(乙酸+乙酸钾):
酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白SDS、线性DNA沉淀,乙酸钾中和SDS,K中和DNA
8、质粒提取中最关键的操作:
(1)破碎细胞,使内容物释放
(2)变性、复性(3)有效沉淀DNA(4)保存DNA
质粒DNA如何保存:
短期保存水——避免TE对后续工作的影响
TE长期保存-20℃保存(Tris-EDTA)
质粒DNA保存注意的要素:
(1)稳定的PH
(2)避免酶对其降解(3)低温(4)适合离子强度,防止DNA变性
写出以下物质的中文名称及用途
(1)CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,最大的优点是能很好去除糖类杂质,它能与核酸形成复合物,高盐溶解,低盐沉淀。
(2)SDS(十二烷基磺酸钠):
在较高温度条件下裂解细胞,使染色体离析、蛋白质变性、释放核酸
(3)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)去除多酚
(4)DEPC(二乙基焦炭酸盐)去除RNA酶
(5)DAPI(4'-6二咪基-2-苯基
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