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northern杂交
RNA提取
方法一、改良异硫氰酸胍提取法
试剂及其配制
异硫氰酸胍变性液:
贮存液-在含484ml水(经DEPC处理),17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍,加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用(不超过3个月)。
工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为:
4mol/L异硫氰酸胍
25mol/L柠檬酸钠pH7.0
0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)
0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)
其它溶液:
2mol/L乙酸钠(NaAc)缓冲液(pH4.0)
水饱和酚(pH3.5)
49∶1(v/v)氯仿/异戊醇
100%异丙醇
70%乙醇(用DEPC处理水配制)
DEPC处理后高压灭菌水
试验程序
1.取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中,加入液氮,迅速研磨成均匀的粉末。
2.将粉末全部移入冰上预冷的离心管中,并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液,轻轻摇动离心管使混合均匀。
3.顺序加入2mol/lNaAc0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml,每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀,最后将离心管盖紧,倒转几次混合均匀,冰浴15min.。
4.4℃条件下15000g离心30min.,将上层水相转移至另一干净的离心管中,并加入等体积的异丙醇,混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
5.4℃条件下13000g离心25min.,小心去除上清液,沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中(体积为第一次变性液的1/3),再加入等体积的异丙醇,混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
6.4℃条件下13000g离心20min.,沉淀用70%乙醇洗一次,晾干后溶于适量体积(50μg/100μl)的DEPC处理水中,检测后分装,置于-70℃低温条件下保存。
注意事项:
RNA提取过程中,为了保证所提取的RNA的纯度和完整性,其中有两个方面的问题需要特别控制,一是去除与RNA结合的蛋白质,二避免内外源Rnase对RNA的降解。
在RNA的提取中,常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠(SDS)等。
为防止外源Rnase的污染,所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌,所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。
内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。
为避免人体污染,所有试验操作均应带手套,避免人体接触所有用品。
方法二、改良Krapp提取法
试剂及其配制
RNA抽提掖:
母液:
4mol异硫氰酸胍
20mmolEDTA
20mmolMES
pH7.0
工作液:
取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。
RNA重悬液:
2molLiCl
10mmolNaAc
调整终体积为250ml,pH5.2,灭菌后贮存在4℃条件下备用。
试验程序
1.取新鲜植物材料0.5~1g,冷冻干燥。
如果必要可加入0.2g砂一起研磨,然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。
2.4℃条件下8000rpm离心10min.,将上层水相转移至一干净离心管中,加入等体积的酚/氯仿抽提掖,在4℃条件下8000rpm离心10min.。
3.上清液转移至一干净离心管中,再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混匀后,在4℃条件下8000rpm离心10min.)。
4.小心将上清液转移至另一干净离心管中,加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇,在-80℃条件下沉淀2小时。
5.在4℃条件下8500rpm离心30min.,小心弃去上清液,沉淀重悬于RNA重悬液中,置于4℃条件下1小时。
6.4℃条件下8500rpm离心10min.,弃去上清液,沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。
检测后分装,置于-70℃条件下保存。
RNA质量检测
2、RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。
实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。
方法一、紫外吸收检测
试剂:
TE(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA)。
dH2O
试验程序
1.预热紫外分光光度计10~20min.。
2.取两个1ml的狭缝石英杯,一个装入1mlTE溶液作为空白校正液,用来校正分光度计零点及调整透光度至100。
3.取4μlRNA待测样品加入另一比色杯中,加dH2O至1ml,用无菌石蜡膜堵住杯口,倒转混匀。
4.将两个比色杯置于分光光度计中,调入射光波长,用空白溶液分别调整T至100、OD至0,然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。
RNA浓度和纯度分析
浓度计算:
对于单链RNA,OD260=1.0时,RNA浓度为40μg/ml,按照上述稀释方式,即OD260=0.1时,其RNA浓度为1μg/ml。
纯度分析:
纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0,小于此比值说明有蛋白或苯酚污染,如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染;OD260/OD230比值应大于2.0,如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。
方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测
试剂及其配制
MOPS缓冲液(10×):
200mmol/LMOPS(pH7.0)
50mmol/LNaAc
10mmol/LEDTA
准确称取41.86gMOPS,6.8gNaAc,3.72gEDTA,先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc,再将MOPS溶解其中,再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA,混匀后用2mol/LdNaOH将调整pH至7.0,最后定溶至1000ml,过滤灭菌后避光保存。
上样染料:
50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝
其它试剂:
甲醛(37%溶液,13.3mol/L)
甲酰胺(去离子)
将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合,室温搅拌1小时后用Whatman滤纸过滤。
等分成1ml于-70℃贮存。
溴化乙锭(EB,10mg/ml)
70%乙醇
试验程序
1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
2.配制琼脂糖凝胶:
称取0.5g琼脂糖,置于干净的烧瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热溶化均匀。
3.待胶凉至60~70℃时,依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭,混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。
4.样品制备:
取DEPC处理过的500μl小离心管,依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺(去离子)10μl、RNA样品4.5μl,混合均匀;将离心管置于60℃水浴中保温10min.,再置于冰上2min.;向每管中加入3μl上样染料,混匀。
5.上样:
将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极),加入电泳缓冲液(1×MOPS缓冲液),液面高出胶面1~2mm,小心拔出梳子使样品孔保持完好。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔,每孔上样20~40μl。
6.电泳:
盖上电泳槽,接通电源,样品端接负极,于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右,当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后,即可在紫外灯下检测结果。
RNA样品质量分析:
完整的总RNA样品应呈现出三条条带,分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。
其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍,这表明RNA样品比较完整,基本无降解。
如果两条带的亮度反过来,则说明RNA样品已发生降解。
如果在点样槽内或槽附近有荧光区带,则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28SrRNA及18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率,以此可作为分子量的参考。
为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆
A.载体选择
为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板,其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子,同时,为了获得理想的Northern杂交试验结果,载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体,以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有:
pGEM-3/pGEM-4(2.87kb,SP6/T7).
pGEM-3Z(2.74kb,T7/SP6).
PGEM-3Zf(-)(3.2kb,T7/SP6).
BluescriptM13-(2.96kb,T7/T3).
按照试验的经济有效原则,本试验选用BluescriptM13-。
B.目的DNA序列与载体连接
从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆,扩增后提取质粒,采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断;采用标准质粒提取方法提取载体质粒(见黄健试验)。
然后按下列程序进行连接。
试剂及其制备
T4DNA连接酶
连接缓冲液(可直接购买或配制),10X缓冲液配方为:
0.5mol/LTris-HClpH7.8
0.1mol/LMgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)
ATP5mmol/L(如果直接购买商品缓冲液,有的已加在缓冲液中,但有些需单独加入)。
BSA0.25mg/L
PEG(3500~8000均可,在缓冲液中加入2%~3%的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水(SDW)
试验程序
1.建立以下反应体系(终体积20μl):
4μl质粒(50μg/μl)
6μl目的DNA(100μg/μl)
2μl10X连接缓冲液
2μlDNA连接酶
6μl无菌蒸馏水
2.反应管置于15℃条件下保温反应24小时,65℃加热10min.终止反应。
3.取5~10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果,其余反应物于-20℃保存备用。
注意事项
1.保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1,因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接,低浓度的DNA则会增加载体自连。
2.DNA连接酶对温度敏感,在15℃以上会迅速失活,因此,连接反应的温度控制必须严格。
3.为了保证RNA探针的质量,模板DNA片断的完整性和纯度十分重要,在DNA制备时要严格控制。
C.感受态细胞制备(CaCl2法)
试剂及其配制
LB培养基(200ml):
2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2gNaCl,溶解后调整pH至7~8,定溶到200ml混匀,分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl20.1mol/L,4℃保存。
E.coli菌株:
JM105或TG1。
试验程序
1.将单菌落菌株接种于5mlLB培养基中,在37℃条件下振荡培养过夜。
2.取0.5ml过夜培养的菌液接种于50mlLB培养基中,在37℃条件下振荡培养约3小时,用分光光度计检测OD600=0.3~0.4时,取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3.将菌液转入离心管中,在4℃条件下,3500rpm离心5~10min.,弃去上清
4.将沉淀悬浮于预冷的25ml0.1molCaCl2中,在冰上放置30min.后,于4℃条件下,3500rpm离心5~10min.,弃去上清液。
5.沉淀重悬于2ml预冷0.1molCaCl2溶液中,菌液直接用于转化。
或加入1.6ml80%甘油,按每管200μl分装于2ml的冻存管中,于液氮中速冻后-70℃保存备用。
D.质粒DNA转化
试剂及其配制
LB培养基(同C)。
氨苄青霉素:
用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素(AP)的LB平板:
每升LB培养基中加入15g琼脂,溶化后高压灭菌,待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。
在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):
取2g溶于8ml双蒸水中,定容至10ml,过滤灭菌后-20℃保存。
X–Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷):
贮存液浓度为20mg/ml,溶于二甲基甲酰胺中,-20℃黑暗保存。
试验程序
1.取制备分装好的感受态细胞,置于冰上5min.,加入连接产物10μl,轻轻混匀后置于冰上30min.。
2.然后置于42℃水浴中热击细胞50s.,再置于冰上2min.。
3.向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基,37℃下振荡培养1小时
4.与此同时,将LB平板置于37℃下片刻,每板加入44μlIPTG/X-Gal(4μlIPTG和40μlX-Gal)均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。
5.将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上,吹干后(在超净工作台中放置片刻)置于37℃下培养过夜。
含有插入片断的菌落为白色。
E.转化质粒的快速检测
试剂及其配制
煮沸缓冲液:
蔗糖8%
TritonX-1001.5%
EDTA(pH8.0)50mmol/L
Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L
LB培养基(同C)
氨苄青霉素(AP)(同D)
试验程序
1.选取白色单菌落,接种到3ml含AP的LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜。
2.将培养物等分成2份按菌落编号,每一菌落编号切勿出错。
一份于4℃下保存备用,每一菌落编号切勿出错。
另一份转入Eppendorf中,7000rmp离心2min.,弃去上清液,吸干残留液体。
3.将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中,加入25μl溶菌酶后,涡旋混合。
4.将管置于100℃沸水中煮40s.,取出立即在12000rmp条件下离心15min.。
5.取10μl上清液,加入溴酚蓝染料后,在0.8%琼脂糖胶上电泳。
6.在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。
如果不能确定转化片断的大小,则要进一步杂交、测序分析。
选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落,转接于2mlTB培养基(每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠)中,37℃下振荡培养过夜,取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中,再加入150μl50%的甘油,混匀后置于液氮中快速冷冻,再置于-70℃条件下保存。
模板DNA的制备
A.质粒DNA的小量提取
试剂及其配制
含AP的LB液体培养基
TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I:
25mmol/LTris-Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA
50mmol/L葡萄糖
高压灭菌15min.后,4℃贮存。
溶液II:
0.2mol/LNaOH
1%SDS(临用前现配制)
溶液III(100ml):
5mol/L乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
dH2O28.5ml
4℃贮存。
酚∶氯仿(1∶1)
95%和70%乙醇
试验程序
1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中,然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中,37℃下振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中,在4℃下12000rpm离心2min.,弃去上清液,使细菌沉淀尽可能干燥。
3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中,剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II,盖紧离心管口,将其快速颠倒5次(切勿振荡),再加入150μl在冰上预冷的溶液III,盖紧离心管口,将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀,再将离心管置于冰上3~5min.。
4.在4℃下12000rpm离心5min.,将上清液移至另一离心管中。
5.加入等量酚∶氯仿(1∶1),振荡混匀,在4℃下12000rpm离心2min.,将上清液转入另一离心管中。
6.加入二倍体积95%乙醇,振荡混匀,室温放置20min.,在4℃下12000rpm离心5min.,小心弃去上清液,倒置将液滴除尽。
7.用70%乙醇洗涤一次,室温干燥10min.,用50μl含20μg/ml胰RNA酶(无DNA酶)的TE重新溶解质粒DNA,取1μl在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测,其余置于-20℃保存备用。
B.质粒DNA的线性化
试剂及其配制
NotI和SalI内切酶及其相应的缓冲液
酚∶氯仿(1∶1)
3mol/LNaAc(pH5.2)
100%和70%乙醇
DEPC-H2O
试验程序
1.在离心管中依次加入:
质粒DNA10μl(1μg/μl)
10×内切酶缓冲液10μl
dH2O80μl
SalI或NotI2μl(10U/μl)
2.37℃保温反应2小时以上。
3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次,每次在在4℃下12000rpm离心5min.
4.将上清液转入一新的离心管中,加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。
5.4℃下12000rpm离心20min.,弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤一次,真空干燥。
6.线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中,取10μl电泳检测线性化质量,其余于-20℃下保存备用。
RNA探针制备
五、RNA探针制备(根据theDIGsystemuser'sguide)
A.地高辛标记的体外转录
试剂及其配制(试剂盒提供):
10×NTP标记混合物:
inTris-HCl(pH7.5)
10mmolATP
10mmolCTP
10mmolGTP
6.5mmolUTP
3.5mmolDIG-UTP
10×转录缓冲液:
400mmolTris-HCl(pH8.0)
60mmolMgCl2
100mmolDTE(dithioerythritol)
20mmol亚精胺
100mmolNaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μlDNaseI(RNase-free)
20unit/μlRnase抑制剂
20unit/μlT7RNA聚合酶和T3RNA聚合酶
4mol/LLiCl
200mmol/LEDTA
DMPC-H2O
试验程序(带手套操作)
1.在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物(离心管置于冰上):
线性化模板DNA4μl(1μg)
10×NTP标记混合物2μl
10×转录缓冲液2μl
DMPC-H2O10μl
T3或T7RNA聚合酶2μl
2.轻轻混匀反应物,37℃保温反应至少2小时。
3.如果必要,向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI,37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板(由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量,因此,这一步有时也可以省略)。
4.向反应体系中加入2μl200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5.再向反应体系加入2.5μl4mol/LLiCl和75μl冰冷100%乙醇,4℃下沉淀过夜
6.4℃下,12000rpm离心15min.,沉淀用70%冷乙醇洗涤一次,真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中(每一反应体系约10μg),并向其中加入20unitRnase抑制剂,置于-20℃保存备测,检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B.DIG标记有效性检测
RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。
标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测,有两种方法可以选择。
方法一、用标准DIG测试条比较鉴定
使用测试条鉴定包括两个步骤:
首先,将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度,并点样到空白测试条上(对照测试条已用一系列浓度点样);其次,将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应,然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。
试剂及其配制
20×SSC:
3mol/NaCl(175g/L)
0.3mol/L柠檬酸三钠•2H2O(88g/L)
pH7.0
RNA稀释缓冲液:
DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:
3:
2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液:
75mg/mlNBT溶解在DMF(二甲基甲酰胺)中
BCIP溶液:
50mg/mlBCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条:
带正电荷的尼龙膜
对照试剂条:
在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样(300,100,30,10,3pg)
洗膜缓冲液:
100mmolMaleicacid
150mmolNaCl
0.3%(v/v)Tween20
pH7.5
Maleicacid缓冲液:
100mmolMaleicacid
150mmolNaCl
pH7.5
封闭液:
5%(w/v)SDS
17mmol/LNa2HPO4
8mmol/LNaH2PO4
室温保存,如果需要,用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液:
100mmolTris-HCl(pH9.5)
100mmolNaCl
TE缓冲液:
10mmolTris-Cl(pH8.0)
1mmolEDTA
试验程序(带手套操作)
1.将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml,即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液,如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。
2.取5支Eppendorf管,按A、B、C、D、E顺序编号,将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度:
编号RNA标记物稀释方法RNA终浓度
A1μg/mlRNA10μl+RNA稀释缓冲液23μl300pg/μl
B1μg/mlRNA5μl+RNA稀释缓冲液45μl100pg/μl
CA5μl+RNA稀释缓冲液45μl30pg/μl
DB5μl+RNA稀释缓冲液45μl10pg/μl
EC5μl+RNA稀释缓冲液45μl3pg/μl
3.将空白测试条置于一聚酯膜上,以每一浓度1μl的量在测试条上点样,在聚酯膜上做好点样浓度标记,切勿直接在测试条上做任何记号,切勿用手接触测试条。
4.室温干燥约2min.,同时制备测试溶液。
5.在2ml封闭液中加入1μlAnti-DIG-AP。
6.显色底物溶液:
在2ml检测缓冲液中加入9μlNBT溶液和7μlBCIP溶液。
7.准备5个样品池(2.5~5ml容量),1~6顺序编号,依次加入2ml以下溶液。
①.封闭液;
②.抗体溶液(第5项);
③.③④⑤洗膜缓冲液;
④.检测缓冲液;
⑤.显色底物溶液(第6项)
8.将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理,两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①.封闭,2min.→
②.抗体结合,3min.→
①.封闭,1min.→
③.洗膜,1min.→
④.平衡,1min.→
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