iCycler iQ荧光定量PCR仪的操作说明.docx
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iCycleriQ荧光定量PCR仪的操作说明
iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统
操作说明
iCycleriQTMMulti-Color
RealTimePCRDetectionSystem
OperatingInstructions
CatalogNumber
170-8740
如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准
2.iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成
2.1简介:
iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品,且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。
也就是说,只要标记不同荧光探针,iCycler可以对同一个孔中两种以上的PCR产物(最多四种)同时进行实时分析。
这样对多重PCR反应或使用内对照(InternalControl)定量的PCR反应的检测就十分方便。
在反应过程中,不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。
比如,在一个反应管中同时有四种荧光探针共存,分别标记了FAM、HEX、TexasRed®和CyTM5,在收集其荧光信号数据的时候,必须同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、TexasRed滤光镜组和Cy5滤光镜组。
所有的收集的信号由iCycler的软件进行分析整理,在PCR反应结束后,该软件可以显示其各自的荧光曲线和标准曲线,并得到这四种荧光探针分别对应的靶DNA的定量结果。
在每次使用iCycler进行PCR荧光定量实验之前,系统必须获得孔间差异因子(WellFactor)和纯染料校准(PureDyeCalibration)的数据。
系统通过这些数据来区分不同的荧光信号,矫正孔间的误差。
本章节将详细的介绍这两者的调节方法。
您在使用本仪器前请先仔细阅读本章的内容,这将有助于您能够快速地完成实验并获得理想的实验数据。
2.2:
iCycler操作速成
1.开机前先让摄象系统预热30分钟。
接通iCycler的电源,并连上电脑,打开iCycler的软件。
如果本仪器在上次使用后被搬动过,请在RunTimeCentral模块中的ImagingService窗口检查遮光框的校正情况,详见6.2。
2.如果要使用新的荧光染料/滤光镜组,必须进行一次纯染料校准(PureDyeCalibration),使系统获得相关数据,详见2.4。
3.在96孔薄壁反应板(96-wellThinWallplate,产品序列号223-9441)内加入PCR反应试剂和待测样本。
完成后在反应板上盖一块光学级封带(OpticalQualitysealingtape,产品序列号223-9444),用封带涂抹器(塑料扁平齿)将其涂抹光滑。
注意,无论带不带手套,都不要让手指接触到封带表面。
完成后撕去封条四周的白条。
如果不用96孔薄壁PCR反应板,而是用单独的PCR反应管或八连管时,请在加完样品后盖上相匹配的盖子。
注意,为防止放入iCycler的PCR反应管被压碎,在使用绿色抗凝环(greenanticondensationring)时至少放8个反应管;如果没有使用该环,则至少要加14个反应管。
4.在ProtocolWorkshop模块中设置PCR热循环的程序(thermalprotocol),包括温度、时间、循环次数等参数的设置。
详见5.1。
5.在ProtocolWorkshop模块中设置反应板设置文件(PlateSetup)。
先创建一个新的反应板设置文件,再根据本次实验的所用的荧光染料选择其对应的滤光镜设置文件(FliterWheelSetupfile),详见5.2.5。
最后,在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次实验使用哪些孔、样品类型(sampletype)以及要检测的荧光基团种类。
如果样品类型是标准品的话,还要输入其对应的量。
全部完成后再点击“ViewPlateSetup”键,进行确认。
详见5.2。
6.确认上一步中选择的滤光镜组是否就位。
详见5.2.5。
7.如果实验需要使用孔间差异矫正板(externalwellfactorplate)进行系统孔间差异矫正的,先将该板放入iCycler;如果是使用反应板内部矫正的,直接将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler。
详见2.3。
在ProtocolLibrary模块中“ViewProtocol”窗口选择PCR热循环文件;同样在该模块的“ViewPlateSetup”窗口选择反应板设置文件。
完成后按“Run”键。
8.随后系统自动切换到“RunPrep”窗口,用户在此确认PCR热循环文件和反应板设置文件是否正确。
在“Samplevolumeis”文件框中输入反应体系的体积;根据本次实验内容在“IdentifyProtocolAnalysis”中选择是PCR定量/熔点曲线(PCRQuantification/MeltCurve)还是纯染料校准(PureDyeCalibration);在“WellFactorSource”中选择系统孔间差异矫正是使用孔间差异矫正板(WellFactorPlate)还是使用反应板内部矫正(ExperimentalPlate)。
一切都完成后点击“BeginRun”键(见图2.1)。
9.给本次的数据记录文件(opd文件)起名。
10.如果是使用反应板内部矫正的,系统会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据;如果使用了孔间差异矫正板,则系统会先用大约5分钟时间收集孔间差异因子数据,然后自动进入暂停模式(PauseMode )。
取出孔间差异矫正板,将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler中,盖好。
点击“ContinueRunningProtocol”(见图2.6)。
11.PCR循环开始后,系统会打开Run-TimeCentral模块对实验进行实时监控。
当实验进行到荧光收集循环时,DataAnalysis模块会自动打开,进行数据的收集和分析。
2.3:
孔间差异因子(WellFactor)
在采用荧光实时法对PCR反应进行检测的过程中,反应管之间的差异对结果的准确性有一定的影响,这就是所谓的孔间差异因子(WellFactor)。
为了获得更科学更真实的结果,iCycler在PCR反应开始前必须获得孔间差异因子的数据,以便于对每个反应管中荧光信号强度进行矫正。
一般矫正孔间差异因子的方法有两种,一是用孔间差异矫正板(WellFactorPlate),二是反应板内部矫正。
相较而言,在这两种方法中,采用反应板内部矫正是较简单较科学的方法。
这种方法得到的矫正数据也叫动力学孔间差异矫正因子。
使用这个方法的前提是在每个反应管中必须含有相同浓度同种成分的荧光基团。
比如,在一块反应板的每个反应管中都加入50nM荧光素,100nmHEX,125nMTexasRed和200nMCy5,就可以使用反应板内部矫正。
但如果某管中和其他管成分不同,比如某管中荧光素含量为100nM或200nM的话,这种方法就不可行了。
如采用反应板内部矫正,在“RunPrep”窗口的“WellFactorSourse”选项框中选择“ExperimentalPlate”选项即可(见图2.1)。
系统软件会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据。
如果在实验中采用如SYBRGreenI或溴乙啶等能与DNA结合的荧光染料,那么上述方法就无效了。
因为在PCR反应的靶DNA预变性过程中,这样的荧光信号强度比较弱,统计所得的孔间差异因子的数据偏差较大。
解决这个问题的方法有两种,一是采用孔间差异矫正板;二是在PCR主反应液中加入微量的荧光素稀释液(详见2.3.2)。
加入这种稀释液后,在95oC下SYBRGreenI等的荧光信号强度会增加,这样用反应板内部矫正也能得到较准确的孔间差异因子的数据。
2.3.1:
孔间差异因子数据来源(WellFactorSource):
反应板内部矫正(ExperimentalPlate)
如果使用反应板内部矫正的话,荧光探针必须没有二级结构(在纯染料校准时也必须解开二级结构),所以必须在PCR反应板第一次被加热到90oC以上的时候系统才会开始收集荧光信号,并得到孔间差异因子的数据。
2.3.2:
使用反应板内部矫正来进行孔间差异因子矫正操作指南
如果选择使用反应板内部矫正,系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“Dynaicwf.tmo”的文件,95oC加热90秒。
这样用户在设置PCR热循环文件的时候就要考虑到这一点,在预变性段中要减去相应的时间。
比如,您本来的设定是95oC预变性10分钟,这一来您就要改成95oC预变性8.5分钟。
在执行这个插入文件的过程中,被选定的滤光镜组会进入工作位置,系统软件开始收集各反应管中的荧光信号,统计孔间差异因子。
当这些完成后,系统软件的Run-timeCentral界面中会跳出提示信息(见图2.3)。
如果用SYBRGreenI,那么我们建议调节PCR主反应液的荧光染料终浓度为10nM。
先将1mM的荧光素校准染料(FluoresceinCalibrationDye,产品序列号170-8780)用PCR缓冲液(10mMTris,pH8.0,50mMKCl,3mMMgCl2)稀释1000倍,配成1μM的稀释液。
然后按照稀释液:
PCR主反应液=1:
99的比例进行配制,比如10μl1μM稀释液加990μlPCR主反应液,这样就能得到荧光素终浓度为10nM的PCR主反应液。
在反应板内部矫正完成后,系统软件会将其数据储存在本次实验的数据记录(opd文件)中,然后自动开始执行设定的PCR热循环文件。
2.3.3:
孔间差异因子数据来源(WellFactorSource):
孔间差异矫正板(WellFactorPlate)
当一次实验中各反应管中所含的荧光基团的种类和含量不同,比如某反应管含有200nM荧光素而其他反应管只含100nM,或者某反应管用的是TexasRed而其他都用荧光素。
象这样的情况下,孔间差异因子只能用孔间差异矫正板来矫正。
所谓的孔间差异矫正板,就是一块和本次实验一样的PCR反应板,其反应管与实验用PCR反应板的反应管顺序一一对应。
在孔间差异矫正板上,每个反应孔中含有和对应的实验用PCR反应板的反应管中相等体积的溶液以及相同种类和浓度的荧光基团。
比如本次实验用PCR反应板的A1反应管内PCR反应液的总体积是50μl,100nM荧光素,那么孔间差异矫正板的A1反应管也加50μl液体,100nM荧光素。
如果您一个反应管中含有不止一种荧光基团,那么我们建议您在孔间差异差异矫正板上使用我们伯乐公司的孔间差异矫正板稀释液(ExternalWellFactorPlateSolution,产品序列号170-8794),当然只有一种荧光基团也可以使用本产品。
2.3.4:
制备孔间差异矫正板
本公司提供的孔间差异矫正板稀释液是10×的,使用前先用ddH2O稀释10倍。
然后在孔间差异矫正板的反应管中加入与其对应实验用PCR反应板反应管内PCR反应液相同体积的1×孔间差异矫正板稀释液和同样成分的荧光基团。
比如实验用PCR反应板A5反应管内有50μlPCR反应液,100nM荧光素,那么孔间差异矫正板的A5反应管同样要加入50μl1×孔间差异矫正板稀释液(内含荧光素100nM)。
加样完毕后,在板上盖一块干净的光学级封带。
将板略微离心一下,使各反应管管壁上没有液体残留,全部流到反应管底部。
您可以在Run-TimeCentral模块的ImagingService窗口确认准备好的孔间差异矫正板中每管的荧光信号遮光框有没有调节好,CCD照相机像素有没有饱和(详见6.2)。
2.3.5:
使用孔间差异矫正板来进行孔间差异因子矫正操作指南
在一块PCR反应板上进行不同的实验项目或纯染料校准时只能使用本法矫正孔间差异因子。
将准备好的孔间差异矫正板放入iCycler,盖上热盖。
在ProtocolLibrary模块中选择PCR热循环程序和反应板设置文件,然后点击“Run”。
在“RunPrep”界面中的“WellFactorSource”选项框中选择“WellFactorPlate”选项。
其他选项相同。
完成后点击“BeginRun”。
此时系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“External.tmo”的文件,长度为3分钟(见图2.4)。
内容为:
(95oC10秒60oC30秒)×2
60oC1分钟
在此期间系统会收集孔间差异因子数据,Run-TimeCentral模块会显示相应信息(见图2.5)。
系统在孔间差异因子收集完毕后,会进入暂停模式,此时取出孔间差异矫正板,放入实验用PCR反应板,盖好热盖,点击“ContinueRunningProtocol”(见图2.6)。
2.4:
纯染料校准(PureDyeCalibration)和RME文件(RMEFiles)
任何一种荧光染料,第一次在iCycler上使用前,都必须进行一次纯染料校准。
当然如果更换滤光镜组,也是如此。
一种荧光染料/滤光镜组组合在同一台iCycler只需要进行一次纯染料校准(前提是相应的滤光镜组不被更换),其数据会被系统保存,以后实验中可以读取。
纯染料校准的功能,其实就是使系统在收集信号的时候能准确辨认某一种荧光信号。
它的操作方法很简单,就是把相应的荧光染料校准溶液(每种荧光染料有其相应的荧光染料校准溶液)加入反应板的各反应管中,然后放入iCycler,设置、运行一个PCR热循环文件,所得到的校准数据被系统保存在C:
\ProgramFiles\Bio-Rad\iCycler\Ini文件夹的REM.ini文件中。
一次纯染料校准可以同时测定16种不同荧光染料/滤光镜组组合(一次至多含4种不同荧光染料)。
测定完成后,系统自动将数据存入RME文件。
一旦一种荧光染料/滤光镜组组合在一台iCycler上进行过纯染料校准,那在以后在这台iCycler的实验中如果使用到这种组合就可以读取其数据。
只要您进行一次纯染料校准,RME文件就会被更新一次。
如果同种组合再校准一次,那么新的校准数据会覆盖原来的校准数据。
如果一次实验中使用没有进行过纯染料校准的荧光染料/滤光镜组组合时,那么系统会提出警告。
此时必须对这种组合进行一次纯染料校准以更新RME文件。
为了以防万一(比如系统崩溃),您可以在C:
\ProgramFiles\Bio-Rad\iCycler\Ini文件夹中找到RME文件并将其改名备份在硬盘的其他区域或软盘中。
2.4.1:
纯染料校准RME文件例举
因为单种荧光染料可以通过多种滤光镜组检测到,比如TexasRed就可以通过490/530、530/575、548/595、575/620、635/680等滤光镜组检测。
系统必须通过RME文件的记录来辨认通过某滤光镜组收集的荧光信号是对应什么荧光染料的信号。
所以整个RME文件分为许多小文件段。
每个文件段对应每种荧光染料在不同的滤光镜组下的校准数据。
以下是一个荧光染料组合的纯染料校准数据RME存档的例子。
使用的荧光染料为FAM-490和Cy5-635。
[FAM-490]
490/20X_!
_530/30M=5.384598e+003
635/30X_!
_680/30M=1.565864e+001
[CY5-635]
490/20X_!
_530/30M=2.951601e+001
635/30X_!
_680/30M=6.064747e+003
假设再对另外的一种荧光染料组合FAM-490和TexasRed575进行一次纯染料校准,则RME文件将被更新为:
[FAM-490]
490/20X_!
_530/30M=5.332098e+003
635/30X_!
_680/30M=1.565864e+001
575/30X_!
_620/30M=3.864038+001
[TexasRed-575]
490/20X_!
_530/30M=1.40998e+001
575/30X_!
_620/30M=4.737024e+004
[CY5-635]
490/20X_!
_530/30M=2.951601e+001
635/30X_!
_680/30M=6.064747e+003
经过第二次校准后,您可以注意到文件中FAM-490对于490/530滤光镜组的校准数值略有改变,增加了FAM-490对于575/620滤光镜组的校准值和TexasRed-575对于两种滤光镜组的校准值,这是因为第二次校准后RME文件更新造成的;而FAM-490和Cy5-635对于635/680滤光镜组的数据没有改动,这是因为第二次校准没有测试相关数据。
上述第二份REM文件适合于使用FAM-490&TexasRed–575组合和FAM-490&Cy5-635组合以及三种荧光染料单独使用的实验。
但当使用TexasRed–575&Cy5-635组合时就不行。
因为该文件没有TexasRed–575对于635/680滤光镜组的校准值和Cy5-635对于575/620滤光镜组的校准值。
此时只能进行第三次纯染料校准,得到第三份RME文件:
[FAM-490]
490/20X_!
_530/30M=5.632098e+003–未变
635/30X_!
_680/30M=1.565864e+001–未变
575/30X_!
_620/30M=3.864038+001–未变
[TexasRed-575]
490/20X_!
_530/30M=1.40998e+001–未变
575/30X_!
_620/30M=4.81645e+004–更新
635/30X_!
_680/30M=2.64573e+000–新值
[CY5-635]
490/20X_!
_530/30M=2.951601e+001–未变
635/30X_!
_680/30M=6.123537e+003–更新
575/30X_!
_620/30M=4.746395e+001–新值
经过第三次纯染料校准后,这三种荧光染料对应三组滤光镜组的任意组合都可以使用了。
当然,您可以在一次纯染料校准中同时将其全部完成。
2.4.2:
制备纯染料校准反应板(PureDyeCalibrationPlate)
制备纯染料校准板必须使用本公司提供的荧光染料校准溶液(PureDyeCalibrationSolution,产品序列号170-8792)。
每种荧光染料都有其对应的荧光染料校准溶液。
该溶液中含有相应荧光标记的寡核苷酸,其浓度都已经调配到最佳工作状态,所以注意,千万不要对其稀释。
若一次对多种荧光染料(最多4种)进行校准,那么在纯染料校准反应板上加样的时候,必须将其对应的校准溶液分开加到不同反应管中。
纯染料校准反应板制备的具体操作步骤如下:
将第一种荧光染料校准溶液在反应板上加10个反应管,每孔50μl。
若有其他荧光染料则同上操作,至多再加3次(注意要加在未加过样的反应管中)。
加完样后在板上盖一块干净的光学级封带,将反应板略微离心一下,使反应管壁上没有液体残留,全部流到反应管底部。
由于反应板各反应孔中所含荧光染料种类不同,所以必须用孔间差异矫正板来矫正孔间差异因子,具体操作见2.3.4。
对于SYBRGreenI我们建议您准备用500pg/μl的DNA溶液稀释100,000倍的SYBRGreenI的校准液;对于溴乙非啶我们建议你准备同样DNA终浓度为500pg/μl,溴乙非啶终浓度为1μg/ml的校准液。
2.4.2:
纯染料校准上机操作
设置一个PCR热循环文件,内容为:
55oC1分钟
55oC1分钟×10
在软件界面上选择在循环的第二步(55oC,1分钟,10个循环)进行实时检测(显示黄色照相机状图标)(见图2.7)。
设置反应板设置文件。
在模拟96孔模拟图上选择各反应管中所含的荧光染料的种类。
如图2.8,B2-B11反应管中加了荧光素校准溶液;D2-D11反应管中加了TexasRed校准溶液;H2-H11中加了Cy5校准溶液。
把孔间差异矫正板放入iCycler,在ProtocoLibrary模块中选择刚才设置的PCR热循环文件和反应板设置文件,点击“Run”。
在“RunPrep”的界面中,输入反应体系的体积,在“IdentifyProtocolAnalysis”选项框中选择“PureDyeCalibration”。
注意,一旦选择该选项,则在 “WellFactorSourse”选项框中“ExperimentalPlate”选项就会变灰而成为不可选选项(见图2.9)。
点击“BeginRun”。
给本次数据记录文件起名。
此时系统开始收集孔间差异因子数据,详见2.3。
其数据收集完毕后,系统自动进入暂停模式。
取出孔间差异矫正板,放入纯染料校准反应板,点击“ContinueRunningProtocol”。
此时系统开始正式进行纯染料校准数据收集,完成后,系统界面会有提示信息跳出(见图2.10)。
2.5:
1.440(1.0 )版文件的转换
2.5.1:
数据记录(DataFile)
只要在C:
\ProgramFiles\Bio-Rad\iCycler\Ini文件中保存有REM.ini文件并在该文件中有FAM/SYBR的记录,1.440以后各版本的软件都可打开在1.440版软件下保存的实验数据记录。
FAM/SYBR记录的正确格式如下:
[FAM/SYBR]
485DF22_!
_535RDF45=4.021013e+003
在软件版本更新时,系统会自动将RME文件存在原先的位置。
在2.1880以后的版本中,系统会自动将RME的数据保存到opd文件中,所以你可以把你的数据拷贝到另外的一台电脑上进行分析。
如果你在2.1.880版中打开一个1.440版的数据记录,再保存。
那么此时系统中的RME数据也将被写入该数据记录。
注意:
如果当前的RME.ini文件中没有FAM/SYBR的记录,1.440版的数据记录将不能被打开。
当然,上述在2.1.880版中打开再保存一个1.440数据记录来写入RME文件的方法也失效。
2.5.2:
PCR热循环文件(Thermalprotocols)
1.440版中设置的PCR热循环文件通用于以后所有版本的软件。
2.5.3:
反应板设置文件(PlateSetups)
1.440版的反应板设置文件不能和以后的版本通用。
您不能在1.440版以后版本软件中打开或是修改1.440版中设置的反应板设置文件,但可以在其中浏览它的内容,也可以将其打印下来,这样可以很方便地重新设置这些文件。
如果您在新版本软件中使用1.440版的反应板设置文件,系统会提示您该文件需要升级(见图2.11)。
2.6:
1.880(2.0 )版文件的转换
1.880版的文件通用于以后所有版本软件。
3.iCycler系统软件简介
3.1:
iCycler软件界面的构成
iCycler的软件界面分为5个功能模块,分别是“ProtocolLibrary”模块、“ProtocolWorkshop”模块、“RunTimeCentral”模块、“UserProfile”模块和“DataAnalysis”模块。
通过这些模块,用户可以很方便使用iCycler进行各项实验。
如图3.1,这是“ProtocolLi
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