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响应曲面法优化人参总皂苷动态连续循环提取工艺
中药学院本科毕业论文(设计)
题目:
响应曲面法优化人参总皂苷
动态连续循环提取工艺
年级专业2009级制药工程
学号2009033194
姓名赵瑜
指导教师吴庆光
学历职称博士/教授
教师单位中药学院中药学教研室
填表日期2012年2月16日
广州中医药大学学位论文原创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学术论文是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人或集体,均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
学位论文作者签名:
年月日
目录
目录
响应曲面法优化人参总皂苷动态连续循环提取工艺-2-
前言-4-
研究部分-5-
1仪器与试药-5-
1.1仪器-5-
1.2试药-5-
2方法与结果-5-
2.1药材采集与预处理-5-
2.2人参总皂苷的含量测定-6-
2.2.1对照品溶液的制备:
精密称取人参皂苷Re对照品适量,置10ml容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即得0.24mg/ml对照品溶液。
-6-
2.2.2供试品溶液的制备及测定-6-
2.2.3标准曲线的绘制-6-
2.3连续回流提取工艺-7-
2.3.1提取测定方法-7-
2.3.1.1供试品溶液的制备-7-
2.3.1.2测定-7-
2.3.2提取条件的单因素实验-7-
2.3.2.1乙醇体积分数对人参总皂苷转移率的影响-7-
2.3.2.2药材粒径对人参总皂苷转移率的影响-8-
2.3.2.3溶剂流速对人参总皂苷转移率的影响-9-
2.3.2.4浓缩温度对人参总皂苷转移率的影响-10-
2.3.3响应曲面分析实验-11-
2.3.3.1响应曲面分析实验设计-11-
2.3.3.2模型的建立与显著性检验-11-
2.3.3.3拟合模型的建立-13-
2.3.3.4响应面分析-14-
2.3.3.5响应曲面法验证实验-20-
3结论-21-
4讨论-21-
4.1采用动态连续循环提取的特点-21-
4.2本工艺与其他文献报道工艺的优势-21-
4.3响应曲面实验中药材粒径水平的设计及其指标-22-
4.4验证实验的工艺条件-22-
【参考文献】-22-
致谢-23-
响应曲面法优化人参总皂苷动态连续循环提取工艺
作者:
赵瑜(2009级制药工程专业2009033194)
指导老师:
吴庆光(广州中医药大学中药学院中药学教研室)
【摘要】:
目的:
优化人参总皂苷提取工艺。
方法:
以人参总皂苷转移率为指标,在单因素实验考察乙醇体积分数、药材粒径、溶剂流速、浓缩温度对人参总皂苷转移率的影响的基础上,通过响应曲面法对人参总皂苷动态连续循环提取工艺进行优化。
结果:
人参总皂苷的含量与所考察3个因素之间关系符合二次模型。
优化后人参总皂苷的最佳提取工艺为:
乙醇体积分数为78%,超微粉碎时间10min,溶剂流速24ml/min,浓缩温度65℃。
人参总皂苷转移率为85.64%。
结论:
本方法科学、合理、可行,对人参总皂苷提取工艺应用于实际生产有重要的参考价值。
【关键词】:
人参总皂苷;动态连续循环提取;响应曲面法;转移率
OptimizationofDynamicContinuousCircumfluenceExtractionTechnologyofTotalSaponininGinsengFibrousRootbyResponseSurfaceMethodology
Graduate:
ZhaoYu
Supervisor:
WuQingguang
【Abstract】Objective:
Tooptimizetheextractiontechnologyoftotalsaponininginsengfibrousroot.Method:
Bysinglefactorexperimenttoinvestigatetheimpactoftotalsaponintransferrateinginsengfibrousrootaboutalcoholconcentration,particlesizeofthemedicinalmaterials,solventvelocity,concentratetemperatureandtooptimizetheextractiontechnologyoftotalsaponininginsengfibrousrootbyresponsesurfacemethodology.Result:
therelationfittedquadraticmodelbetweencontentoftotalsaponininfibrousrootofpanaxginsengand3factorsinvestigated.Theoptimizedextractiontechnologywasasfollows:
alcoholconcentration:
78%,particlesizeofthemedicinalmaterials:
Ultramicro-pulverizedpowderpulverizedfor10min,solventvelocity:
24ml/min,concentratetemperature:
65℃.Thetransferrateoftotalsaponininginsengfibrousrootwas85.64%.Conclusion:
Thismethodisscientific,reasonableandfeasible,theginsengfibrousrootoftotalsaponinextractiontechnologyappliedinactualproductionhasimportantreferencevalue.
【Keyword】Totalsaponinsofginsengfibrousroot;Continuouscircumfluenceextraction;Responsesurfacemethodology;Transferrate
前言
人参为五加科植物人参PanaxginsengC.AMey的干燥根,具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津养血,安神益智的功效[1]。
大量药学研究表明,皂苷类成分为其发挥临床疗效的主要化学成分之一,近年来,人们围绕着人参皂苷的提取、分离等方面展开了深入细致的研究。
因而在大生产中寻找一种快速、安全、简便、成本低、提取纯度高,而又不破坏成分的皂苷提取纯化工艺方法已成为实际生产中的关键问题。
研究表明,人参皂苷提取工艺考察多采用水煎法、温浸法、乙醇回流法、超声法,而以超声和回流提取效率相对较高[2],而对于具体方法中一些影响皂苷提取率的因素如温度、药材粒径等研究相对较少,同时对于实验设计多以单因素和正交试验为主,前者不能顾及不同因素之间的交互作用,后者则实验工作量大,难免加大实验误差,鉴于此我们以人参总皂苷含量为评价指标,通过动态连续循环提取装置提取皂苷,本研究利用响应曲面法优选最佳提取工艺,为人参皂苷工业化生产提供科学依据。
动态连续循环提取工艺是一种提取与浓缩同步进行的提取方法,提取液连续输送到浓缩装置中,回收的提取溶剂连续添加到提取装置中,药材长时间浸泡在热溶剂中,新提取溶剂不断补充,溶质高速溶出,提取时间短,能耗低,溶剂循环使用,减少溶剂的消耗率,同时有利于有效成分的完全溶出。
此工艺克服了索氏提取法中提取液长时间加热,药材与溶剂接触时间不足等缺点。
可提高中药有效成分进行提取的提取效率,减少溶剂使用量和提取时间,是一项有前途的中药提取技术。
响应曲面法是数学方法和统计方法结合的产物,用于受多个变量影响的问题进行建模和分析,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,是一种优化过程的综合方法。
通过计算机运算,可以达到建立连续变量曲面模型,对影响过程的因子及其交互作用进行评价。
响应曲面法的优点有:
经济性原则,可以使用部分因子设计或特殊反应曲面设计,以较少的实验成本及时间获得不错且有效的资讯;深入探讨因子间交互作用影响,由分析与配适模式来研究因子间的交互作用,并且进而讨论多因子对反应变量影响的程度;获得最优化的条件,根据数学理论求得最优的实验情况,同时利用配适反应方程式绘出模式三度空间曲面图与等高线图,观察并分析出最优的操作条件;减少模拟时间,获得模拟独立变量与反应变量关系之数学模型,借此将实验次数及时间降低。
本文以人参总皂苷含量为评价指标,通过动态连续循环提取装置提取皂苷,本研究利用响应曲面法优选最佳提取工艺,为人参皂苷工业化生产提供科学依据。
研究部分
1仪器与试药
1.1仪器
台式连续粉碎机(DF-25,浙江温岭市林大机械有限公司);细胞破壁超微粉碎机(WKZ-4,山东处青州市精诚医药装备有限公司);紫外分光光度计(BluestarA北京莱伯泰科仪器有限公司);分析天平(万分之一,北京赛多利斯天平有限公司);分析天平(十万分之一,SARTORIUSABS110S型,香港佳立国际有限公司,汕头市能手电器有限公司,慈溪市劳特电气有限公司联营制造);旋转蒸发器(RE-52A,巩义市予华仪器有限责任公司);循环水真空泵(SHZ-(B),巩义市予华仪器有限责任公司);水浴锅(HH-S型,巩义市予华仪器有限责任公司);
1.2试药
人参皂苷Re对照品(中国食品药品检定研究院,批号:
Rg1:
MUST-11041201);香草醛(批号:
20100315,分析纯,天津市百世化工有限公司);高氯酸(批号:
20100904,分析纯,天津市百世化工有限公司);冰醋酸(批号:
20090320,分析纯,天津市百世化工有限公司);乙醇(批号:
20100806,分析纯,天津市百世化工有限公司);人参须(批号为20100824,由霸王(广州)有限公司提供,经广州中医药大学中药学院中药教研室赖小平教授鉴定为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥须根。
2方法与结果
2.1药材采集与预处理
批号为20100824,由霸王(广州)有限公司提供,经广州中医药大学中药学院中药教研室赖小平教授鉴定为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥须根。
样品预处理:
传统粉碎人参须适量,万能粉碎机粉碎,过30目筛,得人参须粗粉,DF-15型连续粉碎机粉碎,过60目筛,得人参须细粉。
超微粉碎人参须细粉适量,分别用细胞破壁超微粉碎机5min,10min,15min,标记为1号超微粉,2号超微粉,3号超微粉。
所制备的药材样品置于密封袋中保存。
2.2人参总皂苷的含量测定
2.2.1对照品溶液的制备:
精密称取人参皂苷Re对照品适量,置10ml容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即得0.24mg/ml对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备及测定
供试品溶液的制备:
精密称取人参须药材0.1g,加75%乙醇50ml,加热回流1.5h,放冷,滤过,收集滤液,减压浓缩至浸膏,用10倍量蒸馏水溶解,溶液置于分液漏斗中。
加乙醚萃取3次(20ml/10ml/5ml),弃去乙醚层。
水层加入水饱和正丁醇萃取4次(30ml/20ml/15ml/10ml),合并正丁醇萃取液,减压回收正丁醇至干,用甲醇分次洗涤转移至25ml量瓶中,甲醇定容,作为供试品溶液。
供试品溶液的测定:
精密吸取待测溶液0.3ml至刻度试管中,水浴蒸干,精密加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml,在60℃下水浴加热15min,冰水冷却10min,精密加入冰醋酸5ml,摇匀,即得待测液,于555nm处测定溶液的吸光度,计算人参皂苷的含量。
2.2.3标准曲线的绘制
精密吸取人参皂苷对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml分别置于刻度试管中,按2.1.2项制备样品测定吸光度,以人参皂苷重量(mg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,如下图所示。
图1人参皂苷Re对照品标准曲线图
结果显示人参皂苷在24.12—193.0μg范围内呈良好的线性关系,相关系数r为0.9996,回归方程为Y=4.997X+0.002809。
2.3连续回流提取工艺
2.3.1提取测定方法
2.3.1.1供试品溶液的制备
称取批号为20100824人参须药材中粉100g,置于提取管中,加入一定体积分数的乙醇溶液1000ml,热水循环加热40min,放出300ml提取液于浓缩装置中浓缩,补充提取管内溶剂至1000ml,调节提取管溶剂流速,3h后停止回流,浓缩液定容至500ml,精密吸取5ml,回收乙醇至无醇味,用10ml蒸馏水分次洗涤,转移至分液漏斗中。
加入乙醚萃取3次(25ml/20ml/20ml)弃去乙醚层。
用水饱和的正丁醇溶液萃取4次(20ml/15ml/15ml/10ml),合并正丁醇萃取液,回收正丁醇至干,用甲醇分次洗涤转移至25ml量瓶中,甲醇定容。
2.3.1.2测定
×100%
各种制备方法下人参总皂苷的含量
按“2.2.3”项下测定方定测定人参总皂苷含量,并计算人参总皂苷的转移率。
各种制备方法下人参总皂苷的含量
人参总皂苷转移率=
2.3.2提取条件的单因素实验
2.3.2.1乙醇体积分数对人参总皂苷转移率的影响
精密称定本品粉末(过三号筛)约0.1g,置圆底烧瓶中,加0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇50ml,加热回流0.5h,按“2.2.3”项下方法制备供试品,并测定人参总皂苷的含量,计算转移率,实验结果见表1,图2。
表1乙醇浓度对人参总皂苷转移率的影响
编号
取样量(g)
乙醇浓度(%)
吸光度
样品含量(mg/g)
人参总皂苷转移率(%)
1
1.0014
80
0.2465
60.53
58.67
2
1.0015
70
0.3011
70.29
68.13
3
1.0016
60
0.2576
62.51
60.59
4
0.9998
50
0.2331
58.23
56.44
5
1.0000
40
0.2150
54.97
53.29
6
0.9996
30
0.1953
51.47
49.89
7
1.0001
20
0.1843
49.47
47.95
8
1.0011
10
0.1610
45.25
43.86
9
1.0014
0
0.1361
40.78
39.53
图2乙醇体积分数对人参总皂苷转移率转移率的影响
实验结果显示,当乙醇浓度为70%时,人参总皂苷的转移率最佳。
2.3.2.2药材粒径对人参总皂苷转移率的影响
精密称取人参须粗粉,中粉,1号超微粉,2号超微粉,3号超微粉各0.1g,用50ml70%乙醇密塞称定重量,回流提取30min,加热回流0.5h,按“2.2.3”项下方法制备供试品,并测定人参总皂苷的含量,计算转移率,实验结果见表2,图3。
表2药材粒径对人参总皂苷转移率的影响
编号
取样量(g)
药材粒径
吸光度
样品含量(mg/g)
人参总皂苷转移率(%)
1
1.0009
粗粉
0.2251
56.73
54.99
2
1.0011
中粗
0.2665
64.13
62.16
3
1.0018
超微粉碎5min
0.3473
78.53
76.12
4
1.0001
超微粉碎10min
0.3624
81.37
78.87
5
1.0014
超微粉碎15min
0.3646
81.66
79.15
图3药材粒径对人参总皂苷转移率的影响
实验结果表明,人参须超微粉总皂苷的转移率明显高于普通粉碎粉末,随着超微粉碎时间的增加,总皂苷的转移率呈现上升趋势。
2.3.2.3溶剂流速对人参总皂苷转移率的影响
称取人参须2号超微粉100g,置于提取罐中,加入一定体积分数的乙醇溶液1000ml,热水循环加热40min,放出300ml提取液于浓缩装置中浓缩,调节浓缩温度为60℃,补充提取罐内溶剂至1000ml,分别调节提取管溶剂流速为10ml/min,15ml/min,20ml/min,25ml/min,30ml/min,按“2.2.3”项下方法制备供试品,并测定人参总皂苷的含量,计算转移率,实验结果见表3,图4。
表3溶剂流速对人参总皂苷转移率的影响
样品编号
样品称重(g)
溶剂流速(ml/min)
吸光度
样品含量(mg/g)
人参总皂苷转移率(%)
1
100
10
0.3205
73.87
71.60
2
100
15
0.4067
89.31
86.57
3
100
20
0.4222
92.09
89.26
4
100
25
0.4082
89.58
86.83
5
100
30
0.4041
88.85
86.12
图4溶剂流速对人参总皂苷转移率的影响
实验结果表明,当溶剂流速为20ml/min时,人参总皂苷的转移率最高,当溶剂流速大于20ml/min时,人参总皂苷转移率呈下降趋势。
2.3.2.4浓缩温度对人参总皂苷转移率的影响
称取参须药材粉末100g,置于提取罐中,加入一定体积分数的乙醇溶液1000ml,热水循环加热40min,放出300ml提取液于浓缩装置中浓缩,分别调节浓缩温度至55℃,60℃,65℃,70℃,75℃,80℃,补充提取管内溶剂至1000ml,分别调节提取管溶剂流速为20ml/min,3h后停止回流,浓缩液定容至500ml,精密吸取0.5ml,按“2.2.3”项下方法制备供试品,并测定人参总皂苷的含量,计算转移率,实验结果见表4,图5。
表4浓缩温度对人参总皂苷转移率的影响
样品编号
样品称重(g)
浓缩温度(℃)
吸光度
样品含量(mg/g)
人参总皂苷转移率(%)
1
100
55
0.4034
88.72
86.00
2
100
60
0.4081
89.56
86.81
3
100
65
0.4092
89.76
87.00
4
100
70
0.4102
89.94
87.18
5
100
75
0.4114
90.16
87.39
6
100
80
0.4119
90.25
87.47
图5浓缩温度对人参总皂苷转移率的影响
实验结果显示,浓缩温度对人参总皂苷的转移率影响不明显。
2.3.3响应曲面分析实验
2.3.3.1响应曲面分析实验设计
单因素实验表明,人参须超微粉总皂苷的转移率明显高于普通粉,故工艺优化实验中均采用人参须超微粉进行,且药材粒径大小用超微粉碎时间表示。
采用分析软件DesignExpert8.0建立四因素三水平Box-Behken模型进行优化设计,确定人参总皂苷的最佳动态连续循环提取条件。
以人参总皂苷转移率(Y)为响应值,溶剂流速(A)、乙醇体积分数(B)、浓缩温度(C)、超微粉碎时间(D)为自变量,试验因素水平编码见表6。
表6试验因素与水平
因素
编码
水平
+1
0
-1
溶剂流速(ml/min)
A
10
20
30
乙醇体积分数(%)
B
60
70
80
浓缩温度(℃)
C
55
60
65
超微粉碎时间(min)
D
5
10
15
2.3.3.2模型的建立与显著性检验
响应曲面法优化人参总皂苷动态连续循环提取工艺实验结果见表7。
利用DesignExpert8.0进行回归分析,回归模型方差分析结果见表8,模型回归方程系数及其显著性检验结果见表9。
表7响应曲面分析实验结果
A:
溶剂流速(ml/min)
B:
乙醇体积分数(%)
C:
浓缩温度(℃)
D:
超微粉碎时间(min)
总皂苷转移率(%)
1
20
70
60
10
82.1
2
10
70
55
10
75.3
3
20
80
65
10
87.9
4
30
70
60
5
84.3
5
10
70
60
5
75.7
6
30
70
60
15
80.4
7
20
60
55
10
81.3
8
20
80
60
5
82.8
9
20
70
60
10
82.4
10
10
70
60
15
69.7
11
30
80
60
10
84.8
12
20
70
65
15
87.3
13
30
70
65
10
84.8
14
20
60
65
10
81.3
15
20
60
60
15
81.3
16
20
60
60
5
78.4
17
30
70
55
10
85.0
18
10
80
60
10
72.8
19
30
60
60
10
74.5
20
20
70
60
10
82.2
21
20
70
55
5
87.3
22
20
70
60
10
87.3
23
20
70
55
15
83.8
24
20
80
55
10
87.6
25
20
70
65
5
83.5
26
20
80
60
15
84.4
27
20
70
60
10
87.2
28
10
70
65
10
75.6
29
10
60
60
10
69.6
表8回归模方差分析
方差来源
平方和SS
自由度df
均方和MS
F
p
模型
732.01
14
52.29
11.16
<0.0001
残差
65.57
14
4.68
失拟项
35.32
10
3.53
0.47
0.8501
纯误差
30.25
4
7.56
总值
797.58
28
表9模型回归方程系数显著性检
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- 响应 曲面 优化 人参 皂苷 动态 连续 循环 提取 工艺