医学分子生物学实验技术.docx

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医学分子生物学实验技术

1、基因：

是遗传的物质基础，是DNA或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。

2、基因组：

是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。

3、逆转录：

以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。

4、聚合酶链反应：

是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。

5、限制性核酸内切酶：

是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

6引物：

是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。

催化游离dNTP之间相互聚合。

7、TaqDNA聚合酶：

从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。

8、退火:

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。

9、启动子：

是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。

10、DNA变性：

当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。

1、RT-PCR的基本原理

将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类

基本原理：

核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。

分类：

1琼脂糖凝胶电泳AGE

2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE

3毛细管电泳

3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度

（1）紫外分光光度法：

先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。

（2）琼脂糖凝胶电泳法：

基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。

4、PCR的基本原理和基本步骤，知道几种PCR

（1）基本原理是以待扩增的DNA分子为模板，以一对人工合成的、分别与模板的5’端和3’端互补的单链寡核苷酸作为引物，在耐热DNA聚合酶催化下，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA；接着以子代DNA为模板再次合成，如此反复循环十数次，最终将原始模板放大数百万倍。

（2）PCR的基本步骤

1.反应体系：

包括模板DNA，耐热DNA聚合酶，两种引物，

4种dNTP和含有镁离子的缓冲液。

2.反应过程

变性:

将反应体系加热加热到94~95度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成单链。

退火：

使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA两条链的3’端互补配对。

退火温度由引物Tm决定，一般比引物的Tm低5度，其范围常在55~68度。

延伸：

将反应体系温度升高到72度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核甘酸逐个添加到引物的3’端，使新链不断延长，直至合成结束。

（3）PCR种类：

反转录PCR，定量RT-PCR，实时荧光定量PCR，

多重PCR,巢式PCR,反向PCR,原位PCR

5、基因组DNA提取的原理（主要应用的试剂和作用）

SDS蛋白酶法：

主要用于提取动物组织细胞的基因组DNA。

（1）首先利用含有SDS、蛋白酶K等成分的DNA抽提缓冲液作用于组织匀浆液，以充分裂解细胞，破坏染色体结构，并使组蛋白及其他胞内蛋白质变性、降解，释放出游离的DNA；

（2）用酚/氯仿、氯仿/异戊醇等有机溶剂依此抽提，除去水相中的蛋白质、酚等杂质；

（3）最后以乙醇或异丙醇沉淀水相即可得到较纯的基因组DNA。

抽提缓冲液中的RNA酶可降解胞内RNA，乙二胺四乙酸（EDTA）则能有效抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。

CTAB法与SDS蛋白酶法提取DNA的过程相似。

6、RT-PCR反应体系中包括哪些试剂？

他们的作用如何？

1.RNA提取试剂：

迅速破碎细胞并抑制细胞内RNase的同时，使核蛋白复合物变性，释放RNA。

2.反转录酶：

以mRNA为模板合成cDNA。

3.第一链cDNA合成试剂盒：

合成cDNA。

4.RT-PCR引物：

催化游离dNTP之间相互聚合。

5.dNTP：

为扩增DNA的原料。

6.Taq DNA聚合酶：

在高热条件下，催化聚合反应。

生物化学与分子生物学实习指导（中文版）

生物化学与分子生物学实习指导

实验一蛋白质含量测定（比色分析法和分光光度法）

实验二从小鼠肝脏中提取DNA

实验三DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳

实验四现代PCR技术

实验五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分离及鉴定

内容一盐析法，凝胶过滤法

内容二纤维素离子交换层析，蛋白含量测定，酶活性测定

内容三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

内容四总结

实验六酶的特异性、激动剂、抑制剂

实验七温度、pH对酶促反应速度的影响

实验八运动对尿中乳酸含量的影响

实验九肝糖原实验

实验十肝脂质的提取及薄层层析

实验一蛋白质含量测定（比色分析法和分光光度法）

【目的要求】

1.掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准曲线的制作及使用，标准管法结果计算

2.熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用

3.了解常用可见光、紫外分光光度计的测定原理及使用

【教学内容】

1.酚试剂法蛋白质含量测定

Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理,722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法测定蛋白质含量原理、操作,标准曲线的制备及使用

2.双缩脲法蛋白质含量测定

自学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算

3.紫外分光光度法蛋白质含量测定

紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV—260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作

【实验原理】

一、比色分析法

许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后生成有色物质。

溶液浓度越大，颜色越深。

因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。

这种方法叫比色分析法。

1.物质的颜色和波长：

可见光：

波长（λ）400—760nm

紫外光：

λ小于400nm

红外光：

λ大于760nm

光的互补：

将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光叫互补光，该现象叫光的互补。

单色光：

白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。

2.溶液的颜色和光吸收的关系：

溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。

溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。

溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。

例如：

一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。

光吸收曲线：

测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标，光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。

3.物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：

当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。

溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。

lgI0/I意义：

当I=I0时，lgI0/I=0，表示溶液完全不吸收光线；

当I＜I0时，lgI0/I值较大，表示溶液对光吸收较多；

当I→0时，lgI0/I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。

由此可见，lgI0/I表示了溶液对光的吸收程度。

表示方法：

光密度OD或D（opticaldensity）

吸光度A（Absorbance）

消光度E（Extinction）

于是，（3）式可写成：

D=KCL

公式中K为消光系数，K=D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。

同一溶质，K值相同。

百分消光系数：

C=1%，L=1cm

克分子消光系数：

C=1克分子浓度，L=1cm

D=KCL意义：

物质对光吸收程度与该物质的消光系数K，溶液浓度C，液层厚度L成正比。

4.待测溶液浓度的计算：

（1）标准管法：

在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：

标准液：

Ds=KsCsLs

待测液：

Du=KuCuLu

其中，Ls=Lu，Ks=Lu，Ds/Du=Cs/Cu

Cu=（Du/Ds）×Cs

（2）标准曲线法：

分析大批待测样品时，采用此法较方便。

先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。

在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。

以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。

待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。

（3）标准系数法：

多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数=标准液浓度/标准液平均光密度，同法测出待测液的光密度代入下式：

C=待测溶液光密度×标准系数

（4）消光系数法：

1%浓度，1cm厚度溶液中测得：

K=E1cm1%

或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：

K=ξ

C=D/E1cm%,或C=D/ξ

常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度,带入上式即可求得C。

优点：

可直接测定，不需呈色，不损失样品,操作简便

注意：

选择1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光区强烈吸收紫外光，不能使用）

二、比色分析的测定方法

1.比色分析法：

原理：

白光透过滤光板后，可得到近似的单色光，让单色光透过有色溶液，然后射到光电池上，光电池受光放出电子，所产生的电流与光的强度成正比关系。

利用滤光板可获得近似的单色光，波长范围30-50nm。

滤光板最易透过的光是有色溶液最易吸收的光。

一般说来，选择滤光板的颜色应与被测溶液的颜色为互补色。

2.分光光度法：

分光光度法使用分光光度计，利用棱镜或光栅获得单色光，波长范围3-5nm，所以比比色分析法的灵敏度，准确度和选择性都要高。

三、比色分析条件的选择

1.波长的选择：

原则“吸收最大，干扰最小”

例：

A，B两种物质，A物质最大吸收峰在a处，B物质在a处也有吸收，对A物质的测定有干扰，故选b处波长进行比色测定以满足以上原则。

2.光密度的选择：

D值读数在检流计标尺中部时，准确度较高，相对误差最小。

一般D=0.05—1

3.显色条件的选择：

比色分析中，常需要利用空白溶液调节仪器的透光率为100%，此时D为0。

空白溶液仅仅不含被测物质，而其它溶液，试剂和处理条件与被测溶液完全相同。

因此，利用空白溶液可消除显色溶液中其它有色物质的干扰，抵消比色杯和试剂对入射光的影响。

四、722型分光光度计的使用

1.选择波长

2．比色杯：

（1）液体3/4—2/3，不可过多或过少。

（2）用擦镜纸擦干外表面液体。

3.灵敏度：

调整后不再动。

4.将装有空白溶液的比色杯放入光路。

原则：

开盖调“D=0”，关盖调“T=100”。

五、752型紫外可见分光光度计的使用

1.选择波长

2．比色杯：

测蛋白、核酸时使用石英比色杯，专机专用，余同上。

3.灵敏度：

调整后不再动。

4.注意：

测蛋白、核酸时，开氘灯。

六、蛋白质的测定

常用方法：

1.根据蛋白质含氮量进行测定的定氮法。

2.根据蛋白质结构或组成的紫外吸收特性进行测定的紫外分光光度法。

3.根据蛋白质与不同呈色试剂反应而进行测定的比色法。

【实验内容】

一、酚试剂法（FolinMethod）

原理：

蛋白质中肽键在碱性溶液中与铜离子形成络合物，此络合物能使酚试剂中的磷钼酸还原产生兰色化合物；同时，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸也能与酚试剂的磷钼酸，磷钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白质的含量成正比。

试剂：

1.碱性铜液

2.酚试剂

3.0.9%NaCl

4.标准牛血清白蛋白溶液（1％）

操作步骤：

1．取上述牛血清白蛋白溶液1.0ml用0.9%NaCl稀释10倍后，按下表操作：

温放置20分钟，每管加酚试剂0.5毫升，立即混匀

3．室温放置30分钟后，以第6管为空白管，选波长650nm比色，读取光密度。

二、双缩脲法（BiuretMethod）

原理：

凡具有两个以上肽键（—CO-NH—）的物质，在碱性溶液中与铜离子反应，形成紫红色络合物，称双缩脲反应。

由于蛋白质含有肽键，也能发生双缩脲反应，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

试剂：

1.双缩脲试剂

2.0.9%NaCl

3．标准血清

4．待测血清

步骤：

1．取3支干净的试管按下表操作：

2．混匀，30分钟后以第3管为空白管，用520nm波长比色，读取光密度。

3．计算：

蛋白质含量g%=（Du/Ds）×标准蛋白浓度

【注意事项】

1．试管洗刷干净，刻度吸管专管专用

2．双缩脲法和酚试剂法两个实验的波长分别为520nm和650nm，测定时注意转换波长

3．比色测定时，勿触及比色杯光面

实验二从小鼠肝脏中提取DNA

【目的要求】

1.掌握DNA分离的原理、各试剂作用及操作过程

2.掌握肝匀浆制备及注意事项

3.熟悉DNA浓度、纯度测定原理及方法,仪器使用

4.了解分子生物学实验技术（录像）

【教学内容】

1.从肝中提取DNA

小鼠处死方法,试剂配制,离心机使用,肝匀浆制备,DNA分离纯化原理及注意事项

2.DNA浓度、纯度测定原理及方法,仪器使用

3.（录像带教学）核酸分离纯化,DNA序列测定,核酸探针标记与分子杂交

【实验原理】

1．生物组织中DNA是以DNA-蛋白质复合物的形式存在

2．在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度小，RNA-蛋白质溶解度大;在浓NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度大，RNA-蛋白质溶解度小（分开DNA和RNA）

3．SDS（十二烷基硫酸钠），使蛋白质变性（分开DNA和蛋白质）

（1）SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位;

（2）SDS可引起蛋白质构象改变

（3）SDS是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性

（4）形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电

4．氯仿-异丙醇可以将蛋白质除去

5．适量的冷无水乙醇可使DNA析出。

6．防止DNA酶解的办法——加入EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）

7．检查DNA纯度：

A260/A280

（1）A260/A280＝1.8，高纯度DNA

（2）A260/A280<1.8，含蛋白质

（3）A260/A280>1.8，含RNA

【试剂】

（1）0.14MNaCl，0.1MEDTA

（2）5MNaCl

（3）30%SDS

（4）氯仿-异丙醇

（5）0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠

（6）冷无水乙醇

【步骤】

一．提取脱氧核糖核蛋白

1.杀鼠取肝3克（2—3只小鼠），15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA洗去血液

2.肝匀浆制备

（1）乳钵中剪碎

（2）15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA

（3）不要用力研磨

3.离心3000rpm10分钟，弃上清

沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA15ml轻轻悬起

离心3000rpm10分钟，弃上清

沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA10ml使之溶解，转至50毫升三角烧瓶中

二．除蛋白质

1.加入30%SDS1ml混匀，60℃水浴轻摇15分钟，取出冷至室温

2.5MNaCl2.75ml,轻摇10分钟

3.氯仿-异丙醇19ml（沉淀蛋白）,轻摇20分钟,离心2500rpm10分

三．粗提DNA

1.吸上清（水相）转入玻璃离心管（含DNA）,弃沉淀（剩余物）

2.加入1.5倍体积冰乙醇（无水乙醇）轻摇至DNA析出

四．检测

1．用镊子或玻璃棒取出置试管中，加入0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠1毫升

2．稀释适当倍数：

量取10-50μl（用0.1ml刻度吸管吸取）原液，用0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠稀释到5ml（稀释100-500倍）

3．测A260/A280（用0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠做空白溶液）

五．计算

1.DNA浓度：

（μg/ml）=A260×50×稀释倍数

2.DNA纯度：

A260/A280

【注意事项】

1.研磨时上下用力，尽量避免DNA链断裂。

2．加入氯仿—异丙醇后勿剧烈摇动，以免大分子断裂。

3．有机溶剂对人体有害，操作时要注意。

实验三DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳

【目的要求】

1.掌握限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用

2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理及其操作

3.熟悉电泳基本原理及其影响因素

【教学内容】

1．限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用

2．DNA片段琼脂糖凝胶电泳

3．电泳概念、分类、应用、基本原理及其影响因素,琼脂糖凝胶制备、加样、电泳及结果分析

【实验】

一．DNA酶解

原理：

1.限制性核酸内切酶：

是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割。

如：

HindⅢA↓AGCTT

EcoRⅠG↓AATTC

HpuⅡC↓CGG

2.酶单位数：

在最适温度、PH条件下，1小时完全水解1μgλDNA所需的酶量为1个单位。

试剂：

（1）λDNA（0.38μg/μl）

（2）HindⅢ（16u/μl）

（3）酶解Buffer（Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT）

（4）反应终止液（溴酚蓝1%，SDS1%，EDTA2%，甘油50%）

方法：

1.取两只EP管

（1）λDNA10μl，双蒸水10μl

（2）λDNA10μl，HindⅢ10μl

充分混匀

2.37℃水浴2小时。

3.保温结束后加入终止液5μl。

二.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）

原理：

1．DNA含有PO43-基团，在pH7.5Buffer中带负电,在电场中向正极移动。

由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开

2．选用适当浓度的凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应（凝胶孔径对大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的，同样条件对Maker电泳，对比观察DNA酶解效果

3．DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590nm可见光）。

标准Maker经溴乙锭（EB）染色可以观察到6条带，分别为:

23Kb,9.9Kb,4.4Kb,4.3Kb,2.2Kb,2.0Kb

试剂：

（1）1%琼脂糖

（2）TAE液

（3）Marker

（4）EB

方法：

1.电泳仪接线：

黑（负）—黑，红（正）—红

2．凝胶槽准备：

用胶布固定胶槽两侧，调整梳子高度距离槽底2-3毫米，调好水平。

3．灌胶：

（1）称取0.8克琼脂糖,加入80毫升TAE中,热浴溶解至透明

（2）60℃左右加入EB100μl（终浓度0.5μg/ml）,倒入备好的凝胶槽中。

应注意胶面平整,无气泡

（3）冷却后,拔去梳子

4．加样:

（1）去掉胶布，将灌好的胶板平放在电泳槽中

（2）加入电极Buffer使之高出胶面（1-3毫米）

（3）用进样器吸样品20μl加入样品槽中

5．电泳:

v=100V,1-1.5小时,至溴酚蓝移出2/3

6．观察:

（戴手套）紫外灯下（254-365nm）,暗处观察,记录。

可见DNA橙红色区带

【注意事项】

1．在EP管加入试剂时要用漩涡混合器混合后离心。

2．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。

3．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。

4．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。

实验四PCR技术

【目的要求】

1．掌握PCR技术概念、原理、方法及应用

2．熟悉PCR仪的使用及注意事项

3．了解TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则

4．了解现代PCR技术的扩展

【教学内容】

1．PCR技术概念、原理、方法、应用及技术扩展

2．TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则

3．PCR仪的使用及注意事项

4．模板的制备

【实验】

原理：

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸片断为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片断得到扩增。

PCR技术实际上是在摸板DNA，引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。

试剂：

1.TaqDNA聚合酶

2.dNTP

3.引物

4.模板

5.缓冲液（50mmol/L,10mmol/L,Tris-HCl,1.5mmol/LMgCl2）

步骤：

1．将PCR反应组分放在冰上解冻，并进行短时间离心以使组分沉降管底

2．根据下列顺序在PCR反应管中加入各反应组分：

3．将反应组分混匀后，加入50μl石蜡油，离心数秒

4．根据下列参数进行PCR扩增：

5.将10μlPCR扩增产物（含1×上样缓冲液）点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外灯下观察DNA扩增产物。

【PCR技术的应用】

1.在法医学上的应用：

一根毛发,一滴血,少量精液,牙齿,口腔上皮细胞可进行DNA鉴定

2.遗传疾病的诊断和治疗：

可在怀孕早期获得少量样品（羊水,绒毛）进行扩增,发现异常

的胎儿早期终止妊娠

3.在艾滋病检测中的应用:

对于大多数AIDS患者，通过血清学方法检测其血清中HIV-1抗体可特异敏感地加以筛查和诊断，但对于疑似HIV-1感染的病例，早期机体内尚无HIV-1抗体产生，或携带病毒的母亲生产的婴儿是否已感染HIV-1（垂直传播，新生儿体内尚无抗体产生），直接检测病毒则十分必要

4.检测癌基因:

可选择性地扩增ras基因百万倍，灵敏度为5-10%，即100个细胞含有5-10个具有ras基因点突变的细胞即可检测出来

5.DNA克隆:

只要知道目的基因的两侧序列，通过一对和模板DNA互补的引物，就可以十分有效地扩增出所