海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在食品保鲜中的应用.docx

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海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在食品保鲜中的应用

综述与专论

生物技术通报

BIOTECHNOLOGYBULLETIN

2011年第3期

海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在

食品保鲜中的应用

宫晓静

1,2

吴燕燕

八、、八、、

（1中国水产科学研究院南海水产研究所,广州510300;2上海海洋大学,上海

201306

海洋无脊椎动物抗菌肽抑菌广谱,稳定性高,且对生物体本身无害,其应用日益引起大量研究者的关注。

综述了抗菌肽的几种类型、抑菌机理,介绍了海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展、存在的问题并分析其在食品保鲜中的应用前景

关键词:

海洋无脊椎动物抗菌肽

抑菌机理

结构

活性

食品保鲜

ReviewonResearchProgressesandApplicationintheFoodPreservationof

AntimicrobialPeptidesfromMarineInvertebrates

GongXiaojing1,

WuYanyan1

（1SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFishery

Sciences,Guangzhou510300;

ShanghaiOceanUniversity,Shanghai,201306

Abstract:

Antimicrobialpeptidesfrommarineinvertebratesarewidebacteriostatic,highstabilityandharmlesstoorganism．So

theirapplicationshaveattractedlargeresearchers'attentionday．bRyedvaieywsontheseveraltypes,

mechanismofantimicrobial,theupdatedresearchprogress,actualproblemsandtheapplicationinthefoodofantimicrobialpeptidesfrommarineinvertebrateswereelu-cidated．

Keywords:

AntimicrobialpeptidesfrommarineinvertebratesBacteriostaticmechanism

StructureActivityFoodpreservation

收稿日期:

2010-09-14基金项目:

海南省重点科技项目计划项目（070121,

ZDXM20100005作者简介:

宫晓静,女,硕士研究生,研究方向:

海洋生物资源

利用;E-mail:

xiaojinggong@163．com通讯作者:

吴燕燕,女,研究员,研究方向:

水产品加工与质量安全;E-

mail:

wyy1028@tom．com抗菌肽（antimicrobialpeptides,

AMPs是一类抗菌活性肽的总称。

自1980年瑞典科学家Boman等

[1]

首次在美国天蚕蛹中分离出第一种特殊抗菌活性肽天蚕素（cecropin以来,到目前为止,已经鉴定的抗菌肽达1000种以上,并且数量还在持续迅猛增长,最新数据可到国际上最权威的抗菌肽数据库（http:

//www．bbcm．univ．trieste．it/tossi查询。

从天然产物中获得抗菌肽并应用于工业,特别是食品保鲜防腐方面的研究是目前国内外的研究热

点。

海洋生物种类高达300－500?

106[2]

其中海洋

大型动物种类有0.5－10?

106[3]

。

海洋无脊椎动物,由于其单独依靠体内免疫机制抵抗入侵细菌或病原体,

因此內源性抗菌肽丰富,成为开发天然抗菌

肽的重要资源。

1抗菌肽的分类

大多数抗菌肽是小分子短肽（＜10kD其三

维结构可用普通的二维核磁共振法获得。

根据抗菌肽的核磁共振结构及其氨基酸序列，可将抗菌肽分为5类。

1.1-螺旋抗菌肽在海洋无脊椎动物抗菌肽中，

这类分子的典型

代表是Clavanins,

是1997年Lee等[4]

从柄海鞘（Styelaclava的血细胞中分离得到的,含有一或两个a螺旋结构,无半胱氨酸残基,具有高效的抗菌活性,但对哺乳动物无细胞毒性。

1.2富含半胱

氨酸的抗菌肽

大多数海洋无脊椎动物防御素都富含半胱氨酸,形成一个或多个分子内二硫桥。

例如,从贻贝Mytilus

edulis中分离得到的防御素（MGD,包含8个半胱氨酸,形成4个分子内二硫

桥,二硫桥的位置是C4-C25、C10-C33、C14-C35和C21-C38[5]。

鲎素（tachyplesins和美洲鲎素II（polyphemusinII属于&折叠抗菌肽,是由20

个氨基酸残基组成，分子内形成一个单一的禺发卡结构，并包含1或2个二硫键

[6]。

1.4不规则氨基酸组成的抗菌肽

有些抗菌肽富含一个或多个特殊氨基酸,这些抗菌肽的结构构象与规则的a-

螺旋或&折叠不同，呈现无规则卷曲结构。

例如，从凡纳对虾血细胞中分离的对

虾肽Penaeidins富含脯氨酸,核磁共振结构研究发现,对虾肽中脯氨酸无规则排列,形成一个无规则的卷曲结构[7]。

1.5含稀有修饰性氨基酸的抗菌肽

少数由稀有修饰性氨基酸组成的抗菌肽在海洋无脊椎动物中异常罕见,大多是从细菌中分离得到的。

deVos等[8]从乳酸乳球菌中分离的乳酸链球菌肽（nisin就是这种抗菌肽,由稀有修饰性氨基酸羊毛硫氨酸、3-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨

酸和脱氢酪氨酸组成。

该类抗菌肽抑制G+菌,由于经过翻译后修饰,导致它们没有确定的结构构象。

2抗菌肽的抑菌机理

有关抗菌肽的抑菌机理表明,抗菌肽存在多种抑菌模式,但其共同点是抗菌肽只有接近或接触细胞膜时才具有抑菌功效。

一般认为,抗菌肽的两亲性螺旋结构与细胞膜上的磷脂头簇电荷相互作用,有选择性的破裂细胞膜,使靶细胞内容物外泄致死,或进入靶细胞内部,阻止蛋白质合成而致死靶细胞,从而达到抗菌的作用。

抗菌肽与细胞膜作用主要采用两种模式:

第一种是“桶木”模式[9],抗菌肽

的两亲性a螺旋簇作用细胞膜，形成跨膜渠道，它们的疏水表面与膜类脂中心作用,而亲水表面插入内部形成水孔;第二种是“地毯”模式[10],抗菌肽首先插入靶细胞膜表面,然后以毯式法覆盖靶目标,高浓度的抗菌肽与膜外磷脂头簇作用而

。

而对于G

导致膜渗透。

对于G+菌,抗菌肽结合膜表面肽聚糖层而穿透质膜－菌,则与外膜上的带负电脂多糖相互作用而破坏外膜。

一般情况下,免疫反应后仍会有一部分抗菌肽继续留在细胞内,以防止病原体的复生或杀死残留病原体,

抗菌肽的作用机制,让细菌很难产生抗性,这对于开发新型抗菌肽防腐剂很重要。

3海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展

3.1甲壳动物抗菌肽

甲壳动物抗菌肽主要存在于血细胞中。

1972年,Stewart等[11]发现鳌龙虾的血浆具有抑菌活性;1978年,Mori等[12]发现鳌龙虾的肝胰腺具有同样的抑菌活性。

依据这些发现,White等［13］推测甲壳动物血液中致病微生物的控制受血细胞介导。

10年后,Destoumieux等［14］证实这一推测,他们从凡纳对虾（Penaeusvannamei血细胞中分离出对虾肽Penaeidins（Pen-1Pen-2和Pen-3,其氨基酸残基为19－21个,分子量为5.48－6.62kD,N端富含脯氨酸,C端是一个含3个分子内二硫键的稳定结构域［7］。

对虾肽对G+菌有强烈的抑制作用,而对G－菌的抑制性较弱,并具有广谱抗真菌活性［15］。

Cuth-bertson等［16］从白滨对虾血细胞中化学合成了Pen-4,除具有Pen-1、-2、-3的性质外,其自身还有独特的活性,即抑制G+菌的高效专一性。

Margherita等［17］从大西洋对虾Litopenaeusschmitti和Farfantepenaeuspaulensi的血清cDNA文库克隆出5种对虾肽，其结构分别类似于Pen-2、-4。

近几年，关于Penaeidins结构及功能的研究多不胜数，具体信息可到PEN-base查询。

Schnapp等［18］从岸蟹（Carcinusmaenas中分离出富含脯氨酸的抗菌肽,分子量为6.5kD,序列与Bactenecin-7大致相似,具有广谱抗菌性。

Relf等［19］从岸蟹中分离出富含半胱氨酸的抗菌肽,分子量为11.5kD,含有一个二硫键,对G+菌有

专一抗性。

1982年,Aketagawa等［20］在中国鲎和美洲鲎血细胞溶解产物中发现一种可以抑制鲎血淋巴凝固的阳离子抗脂因子,经测定该抗脂因子强烈抑制R-G

－菌的生长,并具有溶血活性,自此,开辟了人类研究海洋鲎抗菌肽的道路。

直至1988年,日本学者Nakamura等［6］首次在鲎血细胞中发现第一种海洋生物抗菌肽鲎素（tachyplesin。

该肽由17个氨基酸残基组成,C端a精氨酰胺化,4个半胱氨酸,2个二硫键,具有紧密的发卡结构（图1。

在低浓度下鲎素能与细菌脂多糖结合而抑制细菌生长,并对

真菌、病毒等有一定的抗性。

随后,人们又相继发现了鲎素的几种异构体,如鲎素II、鲎素III、美洲鲎素I和美洲鲎素II等,这些异构体的氨基酸序列与鲎素有微小差异，但其活性和功能与鲎素相似。

Kawa-bata等［21］在鲎血细胞的小颗粒中发现一种类似防御素的含有77个氨基酸残基的大防御素（bigde-fensin,该肽N-末端是一个含有35个氨基酸残基的疏水序列，C-末端的37个氨基酸序列与哺乳

动物嗜中性细胞防御素序列类似，二硫键序列则与牛嗜中性细胞&防御素相同，

抑制细菌及真菌生长

图1鲎素I的结构

3.2贝类抗菌肽

目前，对贝类抗菌肽研究较为透彻的是贻贝抗

菌肽。

Charlet等［22］未处理的紫贻贝（Mytilusedulis

血液中分离出抗菌肽和抗真菌肽，经氨基酸序列分

析,这两种肽与防御素高度类似。

后来,Mitta等［23］

从贻贝Mytilusedulis和Mytilusgalloprovincalis血清

中分离出4类抗菌肽,它们分别是:

（1防御素

（MGD,包括MGD-1、-2。

MGD-1广谱抗菌,而对真

核及原虫无细胞毒性;含有38个氨基酸残基,1个

螺旋结构，2个反相3■丝条结构，4个二硫桥，8个半

胱氨酸,其半胱氨酸数比甲壳类防御素多2个;

MGD-1具有防御素类抗菌肽的典型CSa结构⑸

（Cysteine^stabilizedffl2。

（2贻贝素（mytilin,

包括MytilinA、B、C、D、G1。

富含半胱氨酸残基，三维

结构高度紧密;MytilinA、B从Mytilusedulis血清中分

离得到[22];而MytilinC、D、G1从Mytilusgalloprovinca-

lis血细胞中分离得到[24]。

（3贻贝肽[25]（myticin,

包括MyticinA、B。

Myticin富含半胱氨酸残基,形成

多个分子内二硫桥,但其连接方式与MGD-1不同,

因而Myticin具有独特的抗G－菌专一性。

MyticinA

在贻贝血细胞和血清中都有分布;而MyticinB仅分布在血细胞中。

（4贻贝霉素[22]（mytimycin。

存在于Mytilusedulis血清中,含12个半胱氨酸,抗真菌。

图2MGD-1的结构

3.3海鞘抗菌肽

Azumi等［26］从海鞘（Halocynthiaroretzi红细胞中分离出抗菌肽Halocyamine

A、B,具有胞溶活性,

可以抑制人类肝癌细胞的增长。

Lee等［4］从柄海鞘（Styelaclava的血细胞中

发现抗菌肽ClavaninA、B、C、D,由23个氨基酸残基组成,具有a螺旋结构,

C端酰胺化,在分子大小、结构和抗菌活性上类似于从欧洲蟾蜍（Xenopuslaevis中分离的Magain-ins。

随后,Lee［27］纯化出能够抑制人类病原菌的抗菌肽

StyelinsA、B。

Zhao等［28］从柄海鞘咽组织cD-NA文库克隆了StyelinC、D、E,StyelinA-E由32个氨基酸残基组成,富含苯丙氨酸。

后来,Lee等［29］从海鞘（Halocynthiaroretzi中分离出抗菌肽Dicythaurin和Halocidin,其分子量分别为3.4kD和6.2kD,抑菌广谱。

Dicythaurin呈a螺旋构象,C端酰胺化,由单个半胱氨酸二硫键相互连接而构成;Halocidin由两个不同的单体通过二硫键的方式连接而成［30］（图3。

Hinning等［31］从海鞘（CionasubspecieS中鉴定出一种特殊的耐盐

型抗菌肽,该肽强烈抑制细菌及人类或海洋病原体,在受攻击的红细胞中强烈表达。

图3Dicythaurin的结构

4海洋无脊椎动物抗菌肽在食品保鲜中的应用前景

海洋无脊椎动物抗菌肽是小分子肽,扩散比免疫蛋白更迅速,因此其杀菌活力更高,“抗菌谱”更广。

另外,由于海洋无脊椎动物抗菌肽对生物体本身无毒,符合人类食品安全的要求,因而其在食品保鲜、贮藏及加工上的应用具有广阔的潜

在价值。

Bactenecin-7是从牛嗜中性粒细胞分离得到的肽类物质,属于哺乳细胞抗菌肽的Cathelicidin家族。

由于Bactenecin-7能杀死食品传播病原体和腐败微生物、抑制组织损伤、抑菌及溶菌等特性,可以用于活体产品如鱼、虾的防腐保鲜。

Schnapp等［18］从岸蟹（Carcinusmaenas中分离得到的6.5kD抗菌肽,其大小、氨基酸序列与Bactenecin-7大致相似，但抑菌活性比Bactenecin-7更强，抗菌谱更广。

因此,该6.5kD抗菌肽同样具有对食品保鲜防腐的潜力。

Relf等［19］分析了岸蟹（Cardnusmaenas的11.5kD抗菌肽,研究发现该抗菌肽对革兰氏阳性菌有专一抗性,10mg/L即可杀死细菌,并且耐高温、耐盐。

由此可以推断,该抗菌肽可以用于高温、高盐下易被革兰氏阳性菌污染的食品的保鲜。

Khoo等［32］从蓝蟹（Callinectessapidus中分离得到的Callinectin,其抗大肠

杆菌的致死浓度仅为1.44卩mol/L,因此,可以用于易被大肠杆菌污染的食品的保

鲜。

鲎素TachyplesinI,低浓度下能抑制细菌的生长,并对真菌、病毒有一定的抗性作用,在离体条件下,还能抑制病原虫的活性。

研究发现,当鲎素浓度为

500卩g/m时,病原虫活性降低94%［6］。

另外，鲎素具有抗凝血作用,强烈抑制以

脂多糖为媒介的因子C。

因此,鲎素是一种高效的水产品防腐剂,在抑菌的同时,

可以防止血液的流失,达到高度保鲜的作用。

这表明对海洋无脊椎动物抗菌肽的保鲜潜能研究,是一个值得深入挖掘、有可观价值的课题。

Lee等［4］从柄海鞘的血细胞中分离纯化的抗菌肽Clavanins,具有两亲性a螺旋结构。

在微摩尔浓度下,诱导细菌、真菌、原虫和肿瘤细胞的溶解。

研究表明,Clavanins能杀死

13种食品相关病原体,最小抑菌浓度在3-50卩g/mL具有食品保鲜的潜在价值。

贻贝抗菌肽,从贻贝Mytilusedulis和Mytilusgalloprovincalis血清中分离得到,

抑制细菌、酵母菌和霉菌活性。

宋宏霞等［33］研究了贻贝粗抗菌肽对鲈鱼的保鲜,新鲜鲈鱼经冲洗去头后初始细菌总数对数为3.74,经贻贝粗抗菌肽、山梨酸钾和壳聚糖浸泡鲈鱼30min后,晾干,在4?

下保藏,并设立空白组,9d后发现,

经贻贝粗抗菌肽、山梨酸钾和壳聚糖浸泡的鲈鱼细菌总数对数分别上升至6.89、

6.85和6.67,而空白组的细菌总数对数上升至

7.14。

说明贻贝抗菌肽具有一定的保鲜作用,并且达到了山梨酸钾和壳聚糖的保鲜效果。

5研究前景及存在问题

5.1研究前景

由于当前在食品工业中所采用的防腐保鲜剂多为化学合成,从更安全和健康的角度出发,亟需寻找天然高效的食品防腐保鲜剂。

具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。

海洋无脊椎动物抗菌肽不仅具有较强

的抑制细菌、真菌活性,而且对病原体、原虫及癌细胞也有一定的抑制作用。

其特点是:

（1抑菌活性高效、稳定,作用几秒即可杀死病原菌;（2耐热性好,100?

下处理30min其活性不丧失;（3耐盐,在高盐环境下同样具有抗菌活性;（4海洋无脊椎动物抗菌肽具有小分子肽的一切性质,可以被人体内的酶类降解,对人体基本无害。

因此,对海洋无脊椎动物抗菌肽的研究虽然时间不长,但大量研究预示,其抗菌肽在食品工业中的应用将带来食品工业领域的一场“绿色革命”。

5.2存在的问题

尽管海洋无脊椎动物抗菌肽在食品保鲜上有着广阔的应用前景,但也存在一些问题,具体如下:

（1物理因素对分离海洋无脊椎动物抗菌肽的影响大。

细菌诱导、外部温度和盐度变化等物理因素对分离海洋无脊椎动物抗菌肽具有重要影响。

研究发现[34],当外部温度或盐度接近岸蟹的生理耐热或生理盐度范围的边缘时,其体内的抗菌肽强烈表达,而在其承受的范围内,抗菌肽的表达明显减弱;另外,用细菌脂多糖和磷酸盐缓冲液同时诱导紫贻贝,结果发现,用细菌脂多糖诱导的紫贻贝中抗菌肽强烈表达,而用磷酸盐诱导的则没有变化[35]。

而细菌脂多糖是G－菌细胞外膜的一种主要成分,这说明紫贻贝抗菌肽对G－菌有特异抗性。

由此可见,对海洋无脊椎动物抗菌肽的分离提取,在使用先进技术手段的同时,也要把握外部条件的选择,特别重视具有特异菌抗性和对温度或盐度敏感的经济海洋无脊椎动物抗菌肽分离,为今后开展转抗菌肽基因的研究及海洋无脊椎动物抗菌肽的应用研究奠定基础。

（2某些海洋无脊椎动物抗菌肽的活性受多种因素限制。

Cole等[36]鉴定海洋抗菌肽pleurocidin及某些海洋无脊椎动物抗菌肽受镁离子和钙离子限制,在周围环境充满阳离子的情况下,其抗菌肽的活性受限;另外,在生理pH下,海洋无脊椎动物抗菌肽溶解度低,致使其抑菌活力降低。

可见,

海洋无脊椎动物抗菌肽易受多种因素影响,目前这方面的研究刚起步,需要对其活性及稳定性等方面做更进一步的研究。

（3海洋无脊椎动物抗菌肽的安全性问题。

虽然理论上海洋无脊椎动物抗菌肽可以被人体内的酶类降解,但目前,尚无实例证明其抗菌肽的体内外毒性问题,由于它们是非人源抗菌肽,多数具有溶血作用,所以应用于食品加工、保鲜,可能会间接导致人体过敏反应。

因此,应用前大量的体内外检测试验是提高海洋无脊椎动物抗菌肽安全性的必要条件。

5.3今后的研究方向

由于海洋无脊椎动物单独的内生性免疫机制,使体内富含防御黏液,蕴藏着丰富的抗菌肽,以抵御外来各种病原体的入侵。

海洋无脊椎动物抗菌肽特有的性质显示了它在食品保鲜防腐方面的巨大潜力,所以如何分离纯化这些海洋无脊椎动物抗菌肽类物质,改善其最佳化性能和稳定性,并将其安全且高效地应用到食品保鲜,开发出优质且低成本的新型海洋无脊椎动物抗菌肽防腐剂等问题,是今后我们重点研究的方向,有待深入研究。

参考文献

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