十字花科黑腐病菌葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究.docx
- 文档编号:30475396
- 上传时间:2023-08-15
- 格式:DOCX
- 页数:79
- 大小:1.43MB
十字花科黑腐病菌葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究.docx
《十字花科黑腐病菌葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《十字花科黑腐病菌葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究.docx(79页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
十字花科黑腐病菌葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究
十字花科黑腐病菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的研究
摘要
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose6-phosphate1-dehydrogenase,G6PD,EC1.1.1.49)是一个分布很广泛的酶,它在古生菌界、细菌界和真核生物界的体内都存在。
这个酶同时存在于两条代谢途径中,一条是磷酸戊糖途径,一条是2-酮-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸裂解途径。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的第一个酶。
它以NADP+或NAD+为电子受体催化葡萄糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡萄糖酸内酯。
本工作是研究十字花科黑腐病菌中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc8004)是一种植物致病菌。
它能在全球范围内引起十字花科植物发生黑腐病。
根据基因组注释,Xcc8004基因组中两个基因号是编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的,它们分别是XC1977和XC4082。
为了研究XC1977和XC4082基因编码产物的生化功能,本工作通过PCR扩增XC1977和XC4082ORF的DNA同源片段,分别克隆到表达载体pQE30上,并在大肠杆菌M15细胞中分别诱导表达,获得带有六个组氨酸纯化标签的融合蛋白XC1977-His6和XC4082-His6。
对XC1977-His6和XC4082-His6的生化测定发现,两个融合蛋白都具有6-葡萄糖脱氢酶的活性。
进一步分析发现,XC1977-His6酶活性最适温度为37.5℃,最适pH为9.5;XC4082-His6酶活性最适温度分别为32.5℃,最适pH为8.5。
不同的金属离子对XC1977-His6和XC4082-His6影响也不同,Ca2+、Mg2+、Al3+能使XC1977-His6和XC4082-His6活性增强,烷化剂不影响XC1977-His6和XC4082-His6酶活性,Ni2+、Cu2+和Zn2+抑制XC1977-His6活性,Mn2+、Pb2+和Cd2+能使XC1977-His6失活。
Ni2+和Cu2+抑制XC4082-His6活性,Zn2+、Mn2+、Pb2+和Cd2+、能使XC4082-His6失活。
在最适条件下,XC1977-His6以NAD+为电子受体葡萄糖-6-磷酸的Km为0.125mM,Vmax为62.5U/mg。
XC1977-His6以NADP+为电子受体葡萄糖-6-磷酸的Km为0.927mM,Vmax为17.8U/mg。
XC4082-His6以NADP+为电子受体葡萄糖-6-磷酸的Km为0.364mM,Vmax为84.7U/mg。
NAD+不能作为XC4082-His6的电子受体。
关键词:
十字花科黑腐病菌酶活力葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Km值
THERESEARCHOFGLUCOSE-6-PHOSPHATE-1-DEHYDROGENASEINXANTHOMONASCAMPESTRISPV.CAMPESTRIS
ABSTRACT
Glucose6-phosphate1-dehydrogenase(G6PD,EC1.1.1.49)isanenzymepresentinArchaea,bacteriaandalleukaryoticcelltypes.ItisakeyenzymeoftheoxidativepentosephosphatepathwayandtheclassicalEntner–Doudoroff(ED)pathway.G6PDisinvolvedinthefirststepofthepentosephosphatecycle,catalyzingtheoxidationofglucose6-phosphatetogluconolactone6-phosphatewitheitherNADP+orNAD+aselectronacceptor.Xanthomonascampestrispv.campestris(Xcc)8004isapathogenicagentincruciferous,whichcancauseblackrotdiseaseofworldwidecorrosion.G6PDfromXcc8004isencodedbythezwfgene.Inthiswork,twozwfgeneswhichareXC1977andXC4082respectivelywerediscoveredaccordingtobioinformaticsanalysis.Thesetwogenesareisoenzyme.InordertostudythebiochemicalfunctionofXC1977andXC4082,fragmentsoftheintegratedORFofXC1977andXC4082wereamplifiedbyPCRandclonedintoexpressionvectorpQE30,whichwereexpressedinhoststrainE.coliM15.His6-tagfusionproteins,whichweremarkedasXC1977-His6andXC4082-His6respectively,werepurifiedbyPMPSaffinitychromatography.BiochemicalanalysisshowsthatXC1977-His6andXC4082-His6werewithG6PDactivity.Furtherstudyfoundthat,bestG6PDactivitywasdetectedwhileXC1977-His6optimumtemperaturewasresearchedat37.5℃,pH9.5andXC4082-His6at32.5℃,pH8.5respectively.Fuethermore,XC1977-His6andXC4082-His6canbeactiviatedbyCa2+,Mg2+,Al3+,butnotaffectedbyalkylatingagents.Ioneffectsanalysisshowsthat:
theactivationofXC1977-His6waspartilyinhibitedbyNi2+,Cu2+,Zn2+,andtotallyinhibitedbyMn2+,Pb2+,Cd2+,Fe3+.WhileforXC4082-His6,whoseactivationwaspartilyinhibitedbyNi2+,Cu2+andtotallyinhibitedbyZn2+,Mn2+,Pb2+,Cd2+,Fe3+.bothNAD+andNADP+canbeutilizedascoenzymeofXC1977-His6.TheoptimumKmofXC1977-His6withNAD+orNADP+inthereactionbufferwere0.125mMand0.927mMrespectively,whiletheVmaxoftheKmwas62.5U/mgand17.8U/mgrespectively.ForXC4082-His6,onlyNADP+ascanbeascoenzyme.TheKmofXC4082-His6was0.364mMwhileNADP+wasaddedtothereactionbufferandtheVmaxwas84.7U/mg.
KEYWORDS:
Xanthomonascampestrispv.campestris;enzymicactivity;G6PD;Km
目录
第一章前言1
1.1十字花科黑腐病菌(Xcc)的概述1
1.2十字花科黑腐病菌基因组1
1.2.1功能基因组学定义1
1.2.2本实验室的十字花科黑腐病菌的基因组2
1.3葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的结构和功能2
1.3.1G6PD的一级结构2
1.3.2G6PD的二级结构2
1.3.3G6PD的高级结构3
1.3.4G6PD的功能4
1.46-磷酸葡萄糖脱氢酶与Xcc的葡萄糖糖代谢途径的联系5
1.4.1EMP途径5
1.4.2HMP途径6
1.4.3ED途径8
1.5葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的研究进展9
1.6本工作的目的和意义11
第二章材料与方法12
2.1材料12
2.1.1菌株和质粒12
2.1.2本实验所使用的引物13
2.1.3抗生素及其贮存和使用浓度13
2.1.4细菌培养基12
2.1.5菌株培养条件及保存15
2.1.6蛋白质的保存15
2.1.7试剂、溶液与缓冲液15
2.2方法18
2.2.1XC1977和XC4082生物信息学分析18
2.2.2总DNA的提取18
2.2.3质粒的提取19
2.2.4琼脂糖凝胶电泳19
2.2.5常规PCR反应19
2.2.6DNA片段的回收与纯化21
2.2.7电脉冲感受态细胞的制备21
2.2.8限制性内切酶酶切21
2.2.9DNA连接22
2.2.10转化22
2.3蛋白质的操作22
2.3.1目的基因在表达载体上的克隆22
2.3.2目的蛋白的预表达24
2.3.3蛋白质SDS聚丙烯酰胺的电泳24
2.3.4目的蛋白的大量表达25
2.3.5目的蛋白的纯化26
2.3.6NADH和NADPH标准曲线的测定26
2.3.7蛋白含量标准曲线和蛋白质含量的测定26
2.3.8目的蛋白的生化特征分析27
2.4RT-PCR28
2.4.4常规PCR30
2.4.5PCR产物纯化和测序31
2.5GUS报告质粒的构建31
2.6β-葡糖醛酸酶(GUS)活性测定31
2.6.1β-葡糖醛酸酶(GUS)定性检测31
2.6.2β-葡糖醛酸酶(GUS)定量检测32
第三章结果与分析34
3.1XC1977和XC4082编码的蛋白质生物信息学分析34
3.1.1蛋白质氨基酸序列的比对34
3.1.2XC1977和XC4082功能结构域分析及其基本特征36
3.2XC1977和XC4082基因的克隆及其编码产物的过量表达与纯化38
3.2.1XC1977和XC4082ORF的克隆38
3.2.2表达菌株的构建38
3.2.3目的蛋白的表达与纯化40
3.2.4融合蛋白XC1977-His6和XC4082-His6的酶学特征40
3.3XC8004中G6PD的基因的表达44
3.3.1XC4082基因的表达44
3.3.2XC4083与XC4082的转录联系45
3.3.3将目的DNA片段克隆到pK18mob质粒相应的酶切位点46
3.3.4.将目的DNA片段克隆到pL6GUS质粒相应的酶切位点46
3.3.5GUS活性的定性试验47
3.3.6NYGB培养条件下的GUS活性47
3.3.7XC1977P6gus和XC4082P6gus的GUS活性48
第四章结论与讨论50
4.1Xcc8004中XC1977和XC4082编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶50
4.2XC1977-His6和XC4082-His6的生化特性52
4.3XC1977-His6和XC4082-His6与其它物种G6PD的比较53
4.4XC1977和XC4082在Xcc8004可能起的作用53
4.5XC1977和XC4082在Xcc8004的表达54
参考文献55
致谢62
攻读学位期间发表论文情况63
第一章前言
1.1十字花科黑腐病菌(Xcc)的概述
十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc)是属于细菌域、变形菌纲、黄单胞菌目、黄单胞菌科、黄单胞菌属外形为杆状、端生单鞭毛有荚膜的革兰氏阴性细菌。
黄单胞菌是一种植物病菌。
Xcc8004主要是在十字花科植物的维管组织中繁殖生长而使植物致病的。
Xcc8004通过伤口、根部、气孔和维管侵入植物细胞的。
Xcc8004使十字花科植物在全球范围内周期性的发病。
是全球重要的致病菌株之一。
黑腐病在亚洲和非洲的十字花科植物中发病尤为普遍。
具有大规模周期性特点。
在亚洲和非洲气候湿润温度高的地方发病频率更高。
它的频繁发病使分属与十字花科的农作物,如花椰菜、甘蓝、萝卜等大幅减产从而对当地的农业造成巨大经济损失。
防治黑腐病是当务之急。
黑腐病如此流行却没有一个低成本无污染安全有效的防治方法。
本实验室立足于Xcc8004基因功能的研究。
从基因层面上防治黑腐病。
黑腐病在多雨年份发病率极高。
最高时可达到发病率100℅枯死率30℅[1]。
因为Xcc8004主要通过水孔和伤口侵染寄主,所以在水量丰富的地区和多雨季节更要做好预防黑腐病的防范措施。
主要预防措施有以下几点:
(1)对种子预防措施:
链霉素1000倍液浸种后播种
(2)发病初期措施:
喷撒42%加瑞农可性粉剂600-800倍液(3)农田管理措施:
与非十字花科作物进行2~3年轮作。
在雨后及时排水[2]。
1.2十字花科黑腐病菌基因组
1.2.1功能基因组学定义
功能基因组学是指对一个生物的染色体进行全部测序。
然后进行生物生物信息学分析,找出其中的有可能是基因的部分进行标注。
再对有可能是基因的部分进行研究。
又称后基因组学。
1.2.2本实验室的十字花科黑腐病菌的基因组
本实验室的十字花科黑腐病菌Xcc8004的染色体已经全部测序完毕中有250多个基因是直接影响致病性的。
例如一些合成EPS和LPS的基因。
已知全球还有一个和Xcc8004一样进行全基因组测序的菌株。
它是XccATCC33913、Xcc17和XccB100[3]它们同属Xcc菌株。
Xcc8004基因组总长5148708个碱基,GC含量为64.94%,共有4273个ORF被注释,其中2671被认为是有功能的。
占全部ORF的63%。
预测有293个基因与致病相关,有2个rRNA操纵子,53个tRNA基因。
编码蛋白质的基因占总基因的84.7%[3]。
本实验所研究的酶在Xcc8004基因组中有两个基因编码。
其中XC1977位于8004基因组2389694~2391124bp的区域,编码一个由476个氨基酸残基的蛋白,XC4082位于基因组4807606~4809528bp,ORF全长为1920bp编码一个由640个氨基酸残基的蛋白。
1.3葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的结构和功能
1.3.1G6PD的一级结构
在很多的测定结果中发现小鼠肝、大鼠肝、人红细胞和牛肾上腺的G6PD氨基酸组成很相似[8-13]而也就是说哺乳动物的G6DP都是相似的。
G6DP不能用Edman法降解,这说明它的N-端是被乙酰化的[14,15]经过对人白细胞和红细胞、牛肾上腺的G6PD的研究发现N-端是被焦谷氨酰化而封闭[12,16]。
G6PD在哺乳动物体内是以前体形式合成的然后经过转录后翻译加工后才有活性的。
G6PD的N-端氨基酸在微生物中有很大的差异[17,18]在进化关系较远的物种之间G6PD氨基酸序列有很大的差异。
例如酿酒酵母与人的G6PD氨基酸有35%的同源性[19]。
而在进化关系较近的物种之间G6PD氨基酸序列差异性不大。
例如人和大鼠肝的氨基酸序列就有高达95%的同源性[19]。
将已测序的氨基酸序列和它的cDNA序列推导的氨基酸序列比较发现,大多的序列是一致的。
但也有一些是不一样的,这说明有些生物的G6DP基因在翻译是进行了编辑。
1.3.2G6PD的二级结构
G6PD的二级结构也已有学者研究出结果。
我们以枯草芽孢杆菌为例介绍一下G6PD的二级结构。
先提纯枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的G6PD,然后观察在紫外光208nm和222nm处观察它的远紫外圆二色谱。
将得到的光谱根据Chen和Yang的方法计算出G6PD个二级结构的含量表1-1。
表[22]1-1枯草芽孢杆菌G6PD的二级结构含量
Table1-1ThesecondarystructureofG6PD
二级结构
分类及所占比例
名称
α-螺旋
β-折叠
无规则卷曲和折角
总蛋白
所占比例
41.2%
20.6%
38.2%
100%
根据上图可知在G6PD中α-螺旋最多,无规则卷曲和折角次之,β-折叠最少。
1.3.3G6PD的高级结构
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是一个寡聚酶。
它有三种存在形态:
单体、二聚体和四聚体。
(如图1-1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在单体时的酶是没有活性的。
大多微生物的在四聚体时有活性。
二聚体时有的物种的G6PD有活性有的没有活性。
例如猪肝中的G6PD和嗜柠檬酸明串球菌中的G6PD二聚体是有活性的[20]。
在生物体内可通过二聚体与四聚体的互变来调节G6PD的活力[21-23]。
以人红细胞为例解释一下D6PD二聚体与四聚体的互变,当有NADP和巯基存在时两个单体聚合成二聚体[24]。
当NADPH和H+较多时二聚体解离成单体[25,26];当pH较低时,二聚体转化成四聚体;当pH较高时,四聚体转化成二聚体[27](如图1-2)
(a)(b)(c)
图1-1人的G6PD分子的负染电镜图(×300,000)
Fig.1-1HumanG6PDmoleculesnegativelystainedwith2%uranylacetate(×300,000)
a:
Monomersandamodel0fmonomerb:
Dimersandamodelofdimmer
c:
Tetramersandamodeloftetramer
图1-2G6PD高级结构在不同状态的转化
Fig.1-2Equilibriumamongmonomer,dimmerandtetramerofhumanerythrocyteG6PD
1.3.4G6PD的功能
6-磷酸葡萄糖脱氢酶最早是由Warburg和Christian在红细胞中发现的。
接着又在很多哺乳类动物细胞中发现。
G6PD催化D-葡萄糖-6-磷酸氧化成6–磷酸葡萄糖酸内脂同时消耗一分子的NADP生成一分子的NADPH。
虽然在热力学上它是一个可逆反应,但是一分子的6-磷酸葡萄糖酸内脂迅速与水反应生成一分子的6-磷酸葡萄糖酸而使反应变得不可逆了[28,29]。
G6PD广泛的分布在动物界、植物界和微生物中。
G6PD之所以重要是因为它催化了糖代谢途径中戊糖途径中第一个反应。
并且是一个限速反应。
戊糖途径在动物组织细胞中、植物细胞中、微生物中都是已糖磷酸化分流的重要途径。
这个反应还有一个重要的反应产物NADPH。
NADP+重要是因为它参与了很多生物合成反应,例如:
生物合成油脂、氨基酸、减少氧化型的谷胱甘肽。
在人体中NADPH还用来提高过氧化氢酶活性。
过氧化氢酶可以减少氧化型的谷胱甘肽,从而达到维护红细胞结构和功能的作用。
G6PD是磷酸戊糖途径(HMP)第一个酶,也是该途经的主要限速酶,根据辅酶的专一性不同,可将G6PD分为5类[30]:
①NADP+专一型;②NADP+偏爱型;③NAD+与NADP+都可利用型;④NAD+偏爱型⑤NAD+专一型。
同时G6PD可以利用[NADPH]/[NADP+]的比率来调节酶活性。
在HMP途径和[NADPH]/[NADP+]的比率之间有着密切的联系,即该比率调节HMP途径的代谢流量。
葡萄糖胺-6-P是葡萄糖-6-P的竞争性抑制剂[31-33]而对NADP+来说,它是线性混合型抑制剂。
ATP、棕榈酰CoA和磷酸烯醇式丙酮酸强烈抑制具有NAD+偏爱性的G6PD,而不抑制NADP+专一性酶。
G6PD的这些特性决定了它在生物体内不可缺少的地位。
1.4葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与Xcc的葡萄糖糖代谢途径的联系
在十字花科黑腐菌中可能有两种方法吸收葡萄糖的方法。
在十字花科黑腐病菌中的研究可知。
十字花科黑腐病菌的葡萄糖代谢途径相似与绿脓杆菌[34](Pseudomonasaeruginosa)它摄取葡萄糖时有两种方法如图1-3。
第一种是在周质中氧化,主要通过葡萄糖脱氢酶。
反应底物和产物都能通过细胞膜通道。
第二种是进入细胞后在细胞内代谢,主要通过EMP途径、HMP途径和ED途径
图1-3绿脓杆菌中葡萄糖代谢及相关转运系统
Fig1-3Pathwayofglucosecatabolismandrelatedtransportsystems
inPseudomonasaeruginosa
1.4.1EMP途径
EMP途径[35][36](Embden-Meyerhofpathway,EMP):
大多微生物都可利用EMP途径分解葡萄糖。
该途径几乎存在所有微生物的细胞质中,且它在有氧无氧条件下都能进行。
EMP途径以磷酸化葡萄糖起始,以丙酮酸为终产物,整个代谢途径中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶是EMP途径的重要调控酶。
EMP共有10步反应,以是否产能为标准分为两个阶段:
第一阶段为耗能阶段分四步反应:
①葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP
②葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸
③果糖-6-磷酸果糖-1,6-二磷酸
④果糖-1,6-二磷酸磷酸二羟丙酮+甘油醛-3-磷酸
第二阶段称为产能阶段;分五步反应:
①甘油醛-3-磷酸+NAD1,3-二磷酸甘油酸+NADH
②1,3-二磷酸甘油酸+ADP3-磷酸甘油酸+ATP
③3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸
④2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸
⑤磷酸烯醇式丙酮酸+ADP丙酮酸+ATP
图1-4EMP代谢途径
Fig1-4EMPmetabolicpathway
1已糖激酶;2磷酸葡萄糖异构酶;3磷酸果糖激酶;4醛缩酶;
5丙糖磷酸异构酶;6甘油醛-3-磷酸脱氢酶;7磷酸甘油酸激酶;
8磷酸甘油酸变位酶;9烯醇化酶;10丙酮酸激酶
EMP途径的生物学意义:
EMP途径使生物在无氧的情况下依旧可以产能,它产的能量要比ED途径多。
是厌氧菌产能的理想途径。
1.4.2HMP途径
HMP途径[35](hexosemonophosphatepathway,HMP):
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是戊糖途径的第一个酶,也是它的限速酶。
决定葡萄糖是经过戊糖途径进行代谢还是经过其他途径代谢。
所以它在戊糖途径中起总开关的作用。
戊糖途径的核心反应是:
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 十字花科 病菌 葡萄糖 磷酸 脱氢酶 研究