重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征.docx
- 文档编号:30467838
- 上传时间:2023-08-15
- 格式:DOCX
- 页数:19
- 大小:179.08KB
重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征.docx
《重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征.docx(19页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征
毕业论文
题目:
重组人粒细胞集落刺激因子的表达纯化及表征
201年月日
摘要
本文选取大肠杆菌作为基因工程菌,它表达的重组人粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)在细胞中呈现包涵体的形态。
通过破菌、洗涤得到包涵体,再经历溶解、凝胶过滤、复性、疏水以及离子交换柱层析得到了所需要的产物,该产物经过液相和SDS-PAGE电泳测定得到的纯度都很高。
本文分为三部分对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在生物学方面的活性的测定方法进行了初步的探索研究。
在高效疏水色谱(HPlC)条件下优化分离纯化rhG-CSF的洗脱梯度以及流动相流速,实现了复性和同时纯化。
经过1次色谱,rhG-CSF的纯度可达97.5%,rhG-CSF的质量回收率达到25.0%。
关键词:
重组人粒细胞集落刺激因子;分离纯化;高效液相色谱;基因工程
Abstract
Inthispaper,weSelectescherichiacoliasageneticengineeringbacterium,itrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(rhGM-CSF)presentedasinclusionbodyinenginneeredE.coilcells.Throughthebrokenbacteria,washinggetinclusionbody,togothroughdissolution,gelfiltering,resilience,hydrophobicandionexchangechromatographycolumngotneedproduct,theproductafterliquidandsds-pageelectrophoresismeasuredareveryhighpurity.Thispaperisdividedintothreeparts,themeasurginmethodaboutthebiologyactivityofRecombinantHumanGranulocyteColony-StimulatingFactor(rhG-CSF)inthepaperastheinitialresearch.Inhighefficienthydrophobicchromatography(HPLC)conditionsoptimizationpurificationrhGbothg-csf-treatedpatientswiththegradientandmobilephasevelocity,realizetheresilienceandandpurification.Eachtimethroughchromatography,thepurityofrhG-CSFreachupto97.5%,thequalityofrhG-CSFrecoveryratereached25.0%.
Keyword:
rhG-CSF;purification;HPLC;geneticengineering
第一章文献综述
1.1前言
白细胞依照形态的不同一般划分成为颗粒、没有颗粒这两个部分,没有颗粒的白细胞包含淋巴系统细胞以及含有单个核的细胞。
颗粒细胞里面包含与众不同的染色颗粒,用某种特殊染料能够识别出三类不同的白细胞,也就是中性颗粒细胞、嗜酸性颗粒细胞以及嗜碱性的颗粒细胞;没有颗粒的白细胞含有单核的细胞以及淋巴系统细胞[1]。
中性颗粒细胞占据颗粒细胞的大多数分量。
人身体内普遍含有的中性颗粒细胞是抗击病原菌的首条道至关重要的防线,中性颗粒细胞的前一个形态的细胞的比较高的增长繁殖性能以及周边中性颗粒细胞的高级别更替变新的特质,使其变作能够擅长除灭体内增加生殖细胞的细胞毒性制剂的靶向细胞[2]。
所以,受到化学治疗的患有癌症的病人潜在有较大的生产中性颗粒细胞淘汰的危害。
为防范化学治疗药物带来的颗粒细胞减少从而阻止最重大感染事故,许多年以来,实际临床医疗绝大多数选择用重组的人粒细胞集落刺激因子作为主体的升白药来充当资助性的治疗药物,能够使白细胞以及中性颗粒细胞不断变少的过程占用时间比较少,同时也在很大程度上缓和白细胞以及中性的颗粒细胞消失的程度,减少了感染发生的概率以及治疗过程中多用抗生素带来的危害,并收缩了住在医院的期限,使得白细胞以及中性粒细胞不断减少的病症日益消失,从而促使化疗按照期望而顺利进行。
1.2粒细胞集落刺激因子的概述
造血的祖细胞的生存、繁殖以及分裂转化靠的是细胞的造血生长因子,也就是集落刺激因子(CSF)。
集落刺激因子最开始发现于小鼠的身体,随后陆陆续续在人的身体中找到各种各样的相应的集落刺激因子。
各种集落刺激因子尽管在结构上千差万别,粒细胞集落刺激因子属于糖类蛋白质,分子结构中含有一百七十四个氨基酸分子,它的分子总量大概有两万之多。
主要产生于内毒素脂多糖、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、可活化的单核细胞以及巨噬细胞。
粒细胞集落刺激因子基因总长度达到2.5kb,含有五个外显子以及四个内含子,粒细胞集落刺激因子包含有五个半胱氨酸分子,内部形成的两对二硫键是保持粒细胞集落刺激因子在生物学方面的完整功能必不可少的核心因素。
粒细胞集落刺激因子一般应用在中性颗粒细胞系的造血细胞的增长繁殖、分裂转化以及细胞活化过程中[3]。
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)受力在造血的祖细胞之上,能够促使祖细胞的增长繁殖以及分裂转化,其关键的用途在于激发粒细胞以及单核的巨噬细胞变成熟,能够使得成熟的细胞朝向外周血扩散,同时还可以加快促成巨噬细胞和噬酸性细胞的各种各样的功能用途。
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG.CSF)是通过选择大肠杆菌作为发酵菌种发酵获取的基因产品,它的生物学方面的活性以及药理学用途可以加速颗粒细胞集落的出现以及有造血干细胞朝着白细胞方向分裂转化、增长繁殖、成长成熟,它能够增加生长完全的中性粒细胞的存活时长,加快一些相应的酶类的生成,增强中性粒细胞的运动、吞噬细胞病菌、杀灭病菌细菌的能力;而且可诱导骨髓以及血管边缘的细胞池中存在的粒细胞参与外周血液回流循环;不间断地加以利用能够使骨髓的造血干细胞池、各种血细胞的前体细胞池变得更大。
用重组DNA方法得到的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG.CSF)最早的临床应用被批准用于一个正在接受化疗治疗的患有癌症的病人的临床治疗实验过程中,发现第一个治疗周期就表现出能够使中性粒细胞不断在变少的发生过程减少一半[4]。
1.2.1粒细胞集落刺激因子发酵生产研究概况
粒细胞集落刺激因子能够加快颗粒状的造血功能干细胞增长繁殖分裂转化以及壮大发育完全的细胞的功能的用途,关于骨髓移植过程中加快中性化德尔白细胞在数量上的上涨、对癌症顽疾化学治疗时侯随之带来的重大的中性颗粒细胞不足够的症状、还有再生障碍性贫血过程随之而来的中性白细胞缺少症状都有比较显而易见的治疗效果,不过它的天然产物出处极为受限制,与此同时,基因工程的重组粒细胞集落刺激因子在生物学方面的活性同天然的刺激因子极为相像,同时还能够实现大批量的工业生产。
因为原核细胞表达体系没有糖基化等过程翻译后的优化加工功能,生产出来的粒细胞集落刺激因子在人身体内部会部分分解掉从而减弱了药物效果,因此研究者们在真核细胞的表达体系中从事粒细胞集落刺激因子基因的创造,例如在酵母细胞、仓鼠的卵巢部位细胞、T抗原猴子细胞系等表达体系中都已经胜利地完成了粒细胞集落刺激因子的表达[5]。
为了加倍提升粒细胞集落刺激因子(G.CSF)的产品数量,研究人员还把粒细胞集落刺激因子同别的细胞因子合为一体进行表达探究,例如崔立斌等研究者们顺利得到了粒细胞集落刺激因子硫氧还原蛋白的融合蛋白的可溶解表达,表达水平占有总细胞可溶蛋白的四十个百分点。
同时在rhG-CSF的发酵生产方面也有各种各样,种类齐全的研究,例如,刘社际等人探索了培养过程控制的温度对工程菌生长以及rhG-CSF的表达的影响问题,在发酵过程中选取不一样的温度作为培养温度,连续进行三批发酵实验,rhG-CSF的表达量大约有二十七个百分点。
而胡志明等人选取了利用大肠杆菌来表达rhG-CSF的发酵生产工艺流程,在20升的大发酵里面进行培养,得到的rhG-CSF的表达量上升到了三十个百分点[6-7]。
1.3基因工程菌发酵工艺的影响条件
在对基因工程菌的培养基进行选择的过程中,常常要对C源、N源以及无机盐等关键的培养基组成部分作轮流的实验研究,同时要结合单因子的实验,通过数理统计的方法或者极差分析的方法寻找到最好的的培养基成分配料比。
温度是基因工程菌的一个重要的发酵参数。
温度对于基因表达过程的调节作用能够进行于基因复制、基因转录、基因翻译或者低分子量的基因调节分子的合成水平等[8]。
升高温度后温度敏感扩增型质粒复制数就呈现失去控制的情况,对基因工程菌菌体的生长影响深远。
对于这类的质粒重组菌来说,一般是先在比较低的温度下进行培养,随后升高温度,增加质粒复制数量,诱导促使外源基因进行表达,由此得到高的表达。
另外,温度还能够影响到蛋白的活性以及生成包含体过程。
在基因工程菌培养过程中,酸碱PH值普遍采用HCl、H3P04、NaOH、NH3H20等控制在7~8的范围之内。
在菌体生长过程中以及产物的合成过程中,pH的范围要求可能不一样。
除此之外,pH还能够影响包含体的形成过程。
溶氧对基因工程菌菌体生长的平均速率有比较大的影响,普遍采用控制低于临界氧的浓度。
临界氧浓度和菌体的密度息息相关,大多数在饱和溶氧浓度50个百分点以内。
尤其是在进行高密度培养过程中,溶氧这个控制参数至关重要。
采用高密度培养过程中,代谢产物能够阻碍菌体的生长繁殖[9]。
大肠杆菌作为发酵工程菌的发酵过程中,在有氧情况下,葡萄糖的代谢会生产出副产物乙酸或者乳酸。
为了减少代谢副产物,一边在保持高的溶氧浓度,一边要使用流加的方法。
1.4基因工程菌的度培养
基因工程菌的分批培养过程就是把所有的培养营养基同时投入到发酵罐里面,实现发酵过程结束后一次性地得到产物的目的。
补料分批培养是要把种子接种到发酵罐里面进行培养,过一阵子,分批次或者连续不断地添加新的培养基成分,从而使得工程菌菌体再次进行生长繁殖的培养方法。
连续培养法是将菌种子接种到发酵罐里面,然后搅拌使得菌体达到相当的浓度后,调整进料泵以及出料泵的流量比例,从而控制了发酵罐中的一定稀释率来实现连续的培养。
透析培养是将乙酸等不利的代谢产物通过物理方法从培养基中除掉[10]。
其中,分批培养以及补料分批培养是基因工程菌培养过程中最普遍采用的培养方法。
当然,不管使用什么发酵的方法,都必须实时监控发酵过程的各种参数,一旦它们之中的一个条件改变了,就会使得细胞的产量、外源蛋白的生产效率以及细胞的稳定性改变巨大。
1.5粒细胞集落刺激因子的分离、纯化与复性
到目前为止,已经有很多关于粒细胞集落刺激因子分离纯化方法的相关报道。
有一些研究者们提出了使用反相色谱离子交换色谱-排阻色谱纯化法对rhG.CSF进行纯化。
方向东等选择先纯化得到rhG-CSF包含体,使其含量为90个百分点,随之进行复性以及一步离子交换层析,能够使最终的纯度达到95个百分点,质量回收率保持为35个百分点。
储淳等采用“离子交换色谱-疏水层析的方法纯化了rhG.CSF,使得到的产物比活能够达到1.57×108u/mg,纯度达到98个百分点,质量回收率控制为13个百分点[11]。
李福胜等学者采用稀释法复性蛋白,随后通过SP—SeharoseFF阳离子层析技术纯化达到95个百分点的纯度,rhG-CSF的比活性达到了3.4×108u/mg。
普遍采用的方法复性以及纯化rhG—CSF遇到的一些关键核心难题在于:
G.CSF的疏水性能比较强,在对复性进行稀释时,会有相当多的蛋白聚集在一起沉淀下来,而只有很小一部分的蛋白在溶液中进行复性,从而才能继续去实现分离纯化[12]。
1.6重组蛋白的复性
重组蛋白的复性蛋白复性最常用的是稀释、透析或超滤法,但是,这三种方法都存在复性效率低、费时等不足。
因此,研究新的复性方法是基因工程技术产业化的中心环节。
人们在蛋白复性时采取一系列措施,探索体外复性的新方法。
近年来报道较多的蛋白复性新方法主要有下列几种:
分子伴侣催化的蛋白质复性、去污剂协助的蛋白复性、反向微团中的蛋白复性、折叠促进剂的添加、人工分子伴侣帮助蛋白复性、色谱法复性。
其中液相色谱目前已成为分离纯化蛋白质最有效的方法之一,并有望成为基因工程领域内蛋白复性的重要手段[13-14]。
1991年耿信笃首次发现疏水色谱(HIC)可对变性蛋白质进行很好的复性,三年以后,捷克、美国和日本的科学家分别用离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲合色谱成功地使变性蛋白复性;最近Altamirano用亲合色谱将某些在复性缓冲溶液中不能复性的蛋白完全复性,并将此方法命名为再折叠色谱。
与传统的稀释法及透析法比较,用LC法进行蛋白复性的优点是:
(1)快速除去变性剂;有效减小变性蛋白的相互聚集和沉淀,提高蛋白复性的质量和活性回收率:
在蛋白复性的同时可使目标蛋白与杂蛋白分离,使复性和纯化同时进行;有利于回收变性剂,以降低废水处理成本。
目前,能够用于蛋白质复性的Lc方法包括SEC、IEC、HIC与AFC四种。
而最有潜力和应用前景的方法是耿信笃提出的用HIC对变性蛋白复性与同时纯化,这种复性技术已成为基因重组蛋白复性及同时纯化的重要工具,并于翌年申请了国家发明专利现已获批准[15-16]。
第二章实验部分
2.1仪器与试剂
2.1.1rhG.CSF发酵所用到的主要仪器和试剂
主要仪器
采用型号为CT.5的发酵罐,能够控制温度、酸碱度、溶氧率、搅拌速度等发酵条件,同时能够将这些参数的变化值自动予以记录;离心沉降需要用到的仪器为美国科峻公司生产的SORVALLRC28S型号的离心机;恒温振荡器为KY-SHZ-82数显水浴恒温振荡器(北京同德创业科技有限公司);KH-2100法定型双波长薄层色谱扫描仪(上海科哲生化科技有限公司);烘箱为重庆实验设备厂生产的型号为CSl01烘箱;蒸汽消毒器为山东新华医疗器械厂生产的型号为YXDG02的消毒器。
主要试剂
丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(电泳纯)、丙三醇以及溴酚蓝(都由广州化学试剂厂生产),乙醇、乙酸、过硫酸铵、甲醛、硫代硫酸钠、碳酸钠以及硝酸银(国药化学试剂有限公司)。
发酵试剂酵母粉;蛋白胨;酸水解酪蛋白;琼脂(广州化学试剂厂),氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、甘油、蔗糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、硫酸铵(AR,国药集团化学试剂有限公司)。
2.1.2rhG.CSF分离纯化复性所需仪器与试剂
主要仪器
色谱仪使用的是LC-10A高效液相色谱仪,包括主控器、检测器、恒温柱箱、色谱工作站,所用色谱柱是由不锈钢材料制作而成,规格为2×7.9mmI.D.,用匀浆法装填本实验室合成的疏水填料。
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
VC-600-2型号超声波破碎仪(南京皓海仪器仪表有限公司)。
主要试剂
色谱流动相试剂硫酸铵(AR,天津石英钟厂霸州市化工分厂),磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸(AR,西安化学试剂厂)。
变性剂尿素(AR,中国医药集团上海化学试剂公司)。
用于蛋白测定的试剂考马氏亮蓝G-250(Fluka进口分装),三氯乙酸、氯化钠(AR,国药集团化学试剂有限公司),牛血清白蛋(美国Sigma公司)。
2.2试验方法
2.2.1菌种培养基的配制
活化培养基:
50mL×1LB(1%蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl)
(0.5g蛋白胨,0.25g酵母粉,0.5gNaCl,5mgAmp)
种子培养基:
200mL×5LB(1%蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl)
(10g蛋白胨,5g酵母粉,10gNaCl,100mgAmp)
发酵培养基:
23L(1%甘油,3%酵母粉,1%蛋白胨,0.5%NaCl)
(250g甘油,750g酵母粉,250g蛋白胨,125gNaCl,2.5gAmp)
补料培养基:
1L(75g甘油,30g蛋白胨,30g酵母粉)
2.2.2菌种的培养方法
将冻存的菌种接种于活化培养基中,恒温摇床中培养过夜。
活化的种子按照10%的比例转接至种子培养基中扩大培养3h,OD600增长至0.6时按照10%的比例接种至发酵罐。
发酵罐中培养2.5h,待OD600增长至5时升温至42℃开始诱导表达。
诱导表达4h,OD600不再增加时结束发酵过程。
如图1所示是rhG-CSF工程菌的发酵生长曲线:
图1rhG-CSF工程菌的发酵生长曲线
2.3粒细胞集落刺激因子的分离纯化
2.3.1菌体的收集和洗涤
将发酵液用50mL离心管在4oC条件下,以4000r离心,收集沉淀得到菌体,将菌体悬浮于洗涤液中(20mmol/LPBS,lmmol/LEDTA,pH=7.4),室温放置15min后离心,再进行一次洗涤。
2.3.2包涵体的提取
菌体的破碎使用VC-600-2超声波破碎仪来进行。
开始用破菌液(50mMTris-HCl;5mMEDTA;0.2mg/ml溶菌酶;pH=8.5)悬浮菌体,每10g菌体悬浮在100ml破菌液上面,以600W功率来破碎菌体,5min×6次,每次间隔时间为3min,破碎后的菌体在4oC下,12000rpm离心25min,得到的沉淀就是包涵体。
然后将包涵体用洗涤液(21mMTris-HCl,1.1mMEDTA,1.1MNaCl,1.25%TritonX-100,2Murea,pH8.5)洗三次以纯化包涵体,SDS-PAGE分析最后得到的包涵体纯度。
Marker
洗涤前
洗1次
洗2次
洗3次
图2rhG-CSF包涵体的洗涤前后SDS-PAGE检测
2.3.3rhG-CSF表达量的测定
取600微升发酵液进行离心,去除上清液,往下层的固体中加如lx样品缓冲液,均匀搅拌之后,沸水煮5min,进行离心操作。
做SDS-PAGE测试,用Cs-930双波长扫描仪扫描从而来测定rhG.CSF的表达量。
2.3.4SDS-PAGE分析
2.3.4.1溶液的配制
配制考马氏亮兰染色液:
准确称取考马氏亮兰R-2500的质量为0.25g,加入45毫升甲醇以及10毫升醋酸,待它们充分溶解之后,加入超纯水定容到100毫升,摇动使其均匀,过滤之后贮存以备后用。
30%丙烯酸胺/N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的配制:
准确称量29.0克丙烯酸胺,0.8克N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,利用100毫升超纯水加以溶解,过滤之后放入到棕色的试剂瓶中,在40C冰箱中加以保存。
Iris·HCl缓冲液配制:
称取一定质量的Tris碱,用一定体积的超纯水溶解后,用固定浓度的HCl调节使其pH达到所需要的数值,追加入超纯水至溶液总体积为150毫升,在40C的冰箱中加以保存备用。
10%(W/V)SDS的配制:
称取大约10gSDS,并且溶入到90毫升的水里面,搅拌使其完全溶解,注入超纯水到总体积达到l00毫升,室温保存,备用。
10%过硫酸铵溶液的配制:
称取l0克过硫酸铵,溶入到100毫升的超纯水里面,随用随配。
在40C的冰箱温度中保存,但是不能够超过一个星期。
样品缓冲液配制:
用移液管准确移取超纯水4毫升,配制好的0.5mol/l的Tris.HCl溶液1.0毫升,0.8毫升丙三醇,1.6毫升10%的SDS溶液,0.4毫升的β-巯基乙醇,1%的溴酚兰溶液0.4毫升,充分混合均匀之后,贮藏备用。
电泳缓冲液的配制:
准确量15.克碱和94.0克甘氨酸,溶入到900毫升的超纯水中,然后加入50毫升的10%(w/v)SDS电泳级贮存液,追加超纯水至总体积为1000毫升,及配制成5×的贮存液。
银染液的配制:
准确移取1.0毫升20%(w/v)硝酸银溶液,加入80微升的甲醛,用超出水稀释总体积为100毫升。
脱色液的配制:
准确量取甲醇450毫升,乙酸100毫升,充分混合后用超纯水稀释至总体积为1000毫升。
显色液的配制:
称取3.0g的碳酸钠溶入到l00毫升的超纯水中之后,再加入50微升的甲醛和20微升的2%的硫代硫酸钠就可以了。
终止液的配制:
准确量取50毫升甲醇以及12毫升的乙醇,用超纯水稀释至100毫升。
2.3.4.2电泳操作过程
(1)配制并铸分离胶
去离子水2.55ml
1.5mol/LTris·HCL(pH=8.8)2.55ml
10%(W/V)SDS液0.15ml
丙烯酸酰胺/Bis(30%)5.05ml
10%新配制的过硫酸铵(Ap)0.15ml
TEMED(四甲基乙二胺)0.0045rnl
这些溶液中,10%新配制的过硫酸铵(Ap)应该现配现用,每次配制时,过硫酸胺应该最后一个加入,因为它催化聚丙烯酰胺的形成,如果过早的加入,势必会影响到胶的凝固过程以及结果。
(2)配制并铸浓缩胶
去离子水4.05ml
1.5mol/lIris-HCl(pH=6.8)0.75ml
10%(W/V)SDS液0.05ml
丙烯酸酰胺/Bis(30%)1.05ml
10%新配制的过硫酸铵(Ap)0.05ml
TEMED(四甲基乙二胺)0.005ml
2.3.4.3胶的染色
将胶加入到表面非常平整的玻璃器皿里面,注入之前就已经配制好了的含有50%甲醇、12%乙醇以及50微升的甲醛溶液,从而将胶浸泡一个小时以上。
倒入50%乙醇溶液以洗涤胶,使劲晃动玻璃器皿大约一分钟左右,洗涤三次。
再次用0.02%的硫代硫酸钠水溶液浸泡胶体几分钟,紧接着使用超纯水漂洗胶体三次左右。
把胶液浸泡在银染溶液中,轻轻摇晃30分钟以上,用水洗涤几次就可以了。
摇晃的同时慢慢加入显色液直到凝胶体显示出适当的颜色深度,再次用水完全清洗胶体,最后倒入到终止液中浸泡15分钟左右。
最后再利用超纯水进行冲洗的过程,热封并且标记,置于40C的冰箱中贮存起来。
2.3.5Bradford比色法测定蛋白质含量
Bradford比色法测定蛋白质含量的基本原理是利用测定考马氏亮蓝染料和待测蛋白相互结合在一起的数量,并且同与这种考马氏亮蓝染料相互结合的不同数量的标准牛血清白蛋白蛋白质作对比来对未知的蛋白量进行定量分析。
本实验过程为:
分别在6只5毫升的塑料管中加入0.5mg/ml的BSA的体积为5ul、15ul、25ul、35ul、45ul、50ul,以0.15mmol/l的氯化钠补充到总共100微升,同时以100微升的0.15mmol/l的氯化钠作为空白参考对照样。
往每只塑料管中均加入2.0毫升的考马氏亮蓝染料溶液,振荡混合均匀,于室温下放置3分钟。
在595nm
的波长下,用0.5厘米光程的比色皿来测定吸光度A值,同时利用吸光度A值对标准蛋白的浓度作图,能够得到一条比较标准的曲线。
在同样条件下测得到的未知样品的吸光度值,我们从标准曲线上就能够得到待测样品的浓度。
假如待测样品的浓度偏高,进行稀释后再去测定。
2.3.6包涵体的变复性
称取纯化的rhG-CSF包涵体1克,加入1.0毫升的变性剂(6mol/l盐酸胍、50mMTris-HCl、1mMEDTA、1%β-ME(v/v)、pH=8.5)溶解,在250C时变性10小时,通过活性的测定保证其已经充分
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 重组 粒细胞 集落刺激因子 表达 纯化 表征
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)