纸色谱 柱色谱.docx
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纸色谱柱色谱
色谱法
(纸色谱柱色谱)
一、实验目的
1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层析和纸层析的操作技术。
二、基本原理
色谱法(chromatography)亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
开始仅用于分离有色化合物,由于显色方法的引人,现已广泛用于无色化合物的分离和鉴定。
按其分离原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱及排阻色谱等;根据操作条件的不同,又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱及高速(压)液相色谱等类型。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(分配)的不同,或其亲和性的差异,使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用,从而使各组分分离。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂,将一些物质自溶液中吸附到它的表面上,而后用溶剂洗脱或展开,利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用,和它们在溶剂中不同的溶解度,也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
例如A和B两种化合物混合在一起,当它们的溶液通过氧化铝柱时,A和B都被吸附,溶剂继续往下流。
吸附后用极性较大的溶剂冲洗氧化铝柱时,溶剂就替代A和B的位置,被氧化铝吸附,A和B被溶剂溶解(即解吸),随着溶剂自上而下移动,在移动过程中,A和B遇到新的氧化铝时,又被吸附、溶剂继续往下流,又被溶解,如此反复进行,也就是A和B被氧化铝吸附,被溶剂溶解,再吸附,再溶解……因此自上而下慢慢移动,如A的极性较大,则氧化铝对其吸附较强,在溶剂中溶解度较小,也就移动得慢一些。
B的极性较小,则较难被氧化铝吸附,而在溶剂中溶解度较大,也就移动得快些。
随着溶剂的冲洗,二者逐渐分离,最后达到完全分离的目的。
如果继续用溶剂冲洗,B必定选被冲洗出来,而后A被冲洗出来。
多种化合物混合在一起,他们的分离原理也是一样,只是更复杂一些。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
分配色谱主要是利用混合物的组分在两种不相溶的液体中分布情况不同而得到分离。
相当于一种连续性溶剂萃取方法。
这样的分离不经过吸附程序,仅由溶剂的萃取来完成。
固定在柱内的液体称为固定相,用做冲洗的液体叫做流动相。
为了使固定相固定在柱内,需要一种固体如纤维素、硅胶或硅藻土等来吸住它,称为载体或叫担体。
载体本身没有吸附能力,对分离不起什么作用,只是用来使固定相停留在柱内。
进行分离时,也是先将含有固定相的载体装在柱内,加入试样溶液后,用适当的溶剂进行洗脱。
在洗脱过程中,移动相和固定相进行接触。
由于试样各组分在两相之间的分配不同,因此被移动相带着向下移动的速度也不同,易溶于移动相的组分移动得快些,而在固定相中溶解度大的组分就移动得慢一些,因此得到分离。
分配色谱也可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
纸色谱也属于分配色谱。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面
1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物,一般应用化学方法分离很困难,但应用色谱法分离,有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质,不易除去,可利用色谱法分离以除去杂质,得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况,纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离,称比移值(Rf值),所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多,如薄层的厚度,吸附剂颗粒的大小,酸碱性,活性等级,外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以,要获得重现的比移值就比较困难。
为此,在测定某一试样时,最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成,可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失,以证明反应完成与否。
三、柱色谱
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂,以吸收较大量的液体作为固定相。
下面主要介绍以氧化铝为吸附剂的柱色谱分离方法。
1、吸附剂常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
一般多用氧化铝,商品有专供色谱用氧化铝。
柱色谱用的氧化铝以通过100~150目筛孔的颗粒为宜,颗粒太粗,溶液流出太快,分离效果不好。
颗粒太细,表面积大,吸附能力高,但溶液流速太慢,因此应根据实际需要而定。
供色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性三种。
碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱性化合物的分离。
它的水提取物pH值为9~10。
氧化铝水提取液pH值的测定:
取1g氧化铝加入30mL蒸馏水,煮沸10min,冷却,滤去氧化铝,测出滤液的pH值。
中性氧化铝应用最广,适用于醛、酮、醌以及酯类化合物的分离,其水提取液pH值为7.5。
取色谱用碱性氧化铝,加二倍量的5%醋酸溶液煮沸10~20min,随时加以搅拌,放置,倾出上层清液,再用蒸馏水洗5~6次,最后在布氏漏斗上用水洗涤数次,尽可能除去残留的醋酸,抽干,干燥,最后在高温炉中活化。
酸性氧化铝适用于有机酸类的分离。
其水溶液提取液pH值为4~4.5。
可取色谱用碱性氧化铝加入2mol/L盐酸溶液,混合物使刚果红呈酸性反应,倾出上层清液,用蒸馏水洗至洗出液pH值为4,滤集后干燥,加热活化即可。
氧化铝的活化化I~V五级,I级的吸附作用太强,V级的吸附作用太弱。
所以一般常采用II,III级。
多数吸附剂都能强烈的吸水,而且水不易被其他化合物置换,因此其活性降低,且降低的程度与含水量有关。
如氧化铝放在高温炉(350~400℃)烘烤3h,得无水物,加入不同量的水分,即可得到不同程度的活性氧化铝。
见表2.10.1,如要制备III级氧化铝,可在无水氧化铝中加入6%的水即成。
具体操作:
称取无水氧化铝940g,放入圆底烧瓶中并立即塞紧;另在一烧杯中,加入50mL蒸馏水(略少于计算量),逐渐将烧瓶中的氧化铝加入到烧杯中,搅拌均匀使之不再有粘结现象,然后将此烧杯中的氧化铝倒入原来的圆底烧瓶中,振摇3h,测定活性,得到约为III级活性氧化铝。
表2.10.1吸附剂活性和含水量的关系
活性等级
I
II
III
IV
V
氧化铝加水量/%
0
3
6
10
15
硅胶加水量/%
0
5
15
25
38
活性等级的测定,将在薄层色谱一节中介绍。
2、溶质的结构和吸附能力化合物的吸附性和它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团其吸附性较强。
氧化铝对各种化合物的吸附性按下列顺序递减。
酸、碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃。
3、溶解试样的溶剂试样溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离化合物中各种成分的极性、溶解度和吸附剂活性等来考虑:
(1)溶剂要求较纯,如氯仿中含有乙醇、水分及不挥发物质,都会影响试样的吸附和洗脱。
(2)溶剂和氧化铝不能起化学反应。
(3)溶剂的极性应比试样极性小一些,否则试样不易被氧化铝吸附。
(4)溶剂对试样的溶解度不能太大,否则影响吸附;也不能太小,如太小,溶液的体积增加,易使色谱分散。
(5)有时可使用混合溶剂,如有的组分含有较多的极性基团,在极性小的溶剂中溶解度太小,也可先选用极性较大的溶剂溶解。
而后加入一定量的非极性溶剂,这样既降低了溶液的极性,又减少了溶液的体积。
4、洗脱剂试样吸附在氧化铝柱上后,用合适的溶剂进行洗脱,这种溶剂称为洗脱剂。
如果原来用于溶解试样的溶剂冲洗柱子不能达到分离的目的,可改用其他溶剂。
一般极性较大的溶剂影响试样和氧化铝之间的吸附,容易将试样洗脱下来,达不到将试样逐一分离的目的。
因此常使用一系列极性渐次增大的溶剂。
为了逐渐提高溶剂的洗脱能力和分离效果,也可用混合溶剂作为过渡。
先用薄层选择好适宜溶剂。
常用洗脱溶剂的极性按以下次序递增。
己烷、石油醚<环已烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<三氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
5、柱色谱操作步骤
(1)装柱:
色谱柱的大小,视处理量而定,见表2.10.2。
装置如图2.10.1及图1.2.4,先用洗液洗净色谱柱,用水清洗后再用馏水清洗,干燥。
在玻璃管底铺一层玻璃棉或脱脂棉,轻轻塞紧,再在玻璃棉上盖一层厚约0.5cm的石英砂(或用一张比柱直径略小的滤纸代替),而后将氧化铝装入管内。
装入的方法分湿法和干法两种。
湿法是将备用的溶剂装入管内,约为柱高的四分之三,而后将氧化铝和溶剂调成糊状,慢慢地倒入管中。
此时应将管的下端旋塞打开,控制流出速度为1滴/s。
表2.10.2色谱柱大小、吸附剂量及试样量
试样量/g
吸附剂量/g
柱的直径/mm
柱高/mm
0.01
0.3
3.5
30
0.10
3.0
7.5
60
1.00
30.0
16.0
130
10.00
300.0
35.0
280
用木棒或套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身,使装填紧密,当装入量约为柱的四分之三时,再在上面加一层0.5cm的石英砂或一小圆滤纸、玻璃棉或脱脂棉,以保证氧化铝上端顶部平整,不受流入溶剂干扰,如果氧化铝顶端不平,将易产生不规则的色带。
操作时应保持流速,注意不能使液面低于砂子的上层,上面装一分液漏斗。
整个装填过程中不能使氧化铝有裂缝或气泡,否则影响分离效果。
干法是在管的上端放一干燥漏斗,使氧化铝均匀地经干燥漏斗成一细流慢慢装入管中,中间不应间断,时时轻轻敲打柱身,使装填均匀,全部加入后,再加入溶剂,使氧化铝全部润湿。
另外也可先将溶剂加入管内,约为柱高的四分之三处,而后将氧化铝通过一粗颈玻璃漏斗慢慢倒入并轻轻敲击柱身。
此法较简便。
(2)加样:
把要分离的试样配制成适当浓度的溶液。
将氧化铝上多余的溶剂放出,直到柱内液体表面到达氧化铝表面时,停止放出溶剂。
沿管壁加入试样溶液,注意不要使溶液把氧化铝冲松浮起,试样溶液加完后,开启下端旋塞,使液体渐渐放出,至溶剂液面和氧化铝表面相齐(勿使氧化铝表面干燥)即可用溶剂洗脱。
(3)洗脱和分离:
在洗脱和分离的过程中,应当注意:
①连续不断地加入洗脱剂,并保持一定高度的液面,在整个操作中勿使氧化铝表面的溶液流干,一旦流干,再加溶剂,易使氧化铝柱产生气泡和裂缝,影响分离效果。
②收集洗脱液,如试样各组分有颜色,在氧化铝柱上可直接观察。
洗脱后分别收集各个组分。
在多数情况下,化合物没有颜色,收集洗脱液时,多采用等份收集,每份洗脱剂的体积随所用氧化铝的量及试样的分离情况而定。
一般若用50g氧化铝,每份洗脱液的体积常为50mL。
如洗脱液极性较大或试样的各组分结构相近似时,每份收集量要小。
③要控制洗脱液的流出速度,一般不宜太快,太快了柱中交换来不及达到平衡,因而影响分离效果。
④由于氧化铝表面活性较大,有时可能促使某些成分破坏,所以应尽量在一定时间内完成一个柱色谱的分离,以免试样在柱上停留的时间过长,发生变化。
四、纸色谱
纸色谱与吸附色分离原理不同,纸色谱不是以滤纸的吸附作用为主,而是以滤纸作为载体,根据各成分在两相溶剂中分配系数不同而相互分离的。
色谱用的滤纸要求厚薄均匀。
纸色谱和薄层色谱一样,主要用于分离和鉴定,它的优点是便于保存,对亲水性较强的成分如酚和氨基酸分离较好。
但其缺点是所费时间较长,一般要几h到几十h。
滤纸越长,分离越慢,因为溶剂上升速度随高度的增加而减慢。
操作步骤
1、滤纸选择滤纸应厚薄均匀,全纸平整无折痕,滤纸纤维松紧适宜。
将滤纸切成纸条,大小可自行选择,一般约为3cm×20cm,5cm×30cm或8cm×50cm,纸色谱一般装置见图2.10.2。
图2.10.2纸色谱装置图2.10.3纸色谱展开图
1-橡皮塞,2-玻璃钩;3-纸条,
4-溶剂前沿,5-起点线,6-溶剂
2、展开剂根据被分离物质的不同,选用合适的展开剂。
展开剂应对被分离物质有一定的溶解度,溶解度太大,被分离物质会随展开剂跑到前沿;太小,则会留在原点附近,使分离效果不好。
选择展开剂应注意下列几点:
(1)能溶于水的化合物:
以吸附在滤纸上的水做固定相,以与水能混合的有机溶剂(如醇类)做展开剂。
(2)难溶于水的极性化合物:
以非水极性溶剂(如甲酰胺、N,N一二甲基甲酰胺等)做固定相,以不能与固定相混合的非级性溶剂(如环已烷、苯、甲氯化碳、氯仿等)做展开剂。
(3)对不溶于水的非级性化合物:
以非极性溶剂(如液体石蜡、α-溴萘等)做固定相,以极性溶剂(如水、含水的乙醇、含水的酸等)做展开剂。
往往不能使用单一的展开剂。
如常用的正丁醇/水,是指用水饱和的正丁醇。
正丁醇:
醋酸:
水=4:
1:
5是指三种溶剂按其用量比例,放入一分液漏斗中充分振摇混合,放置、分层。
取其上层正丁醇混合液作为展开剂。
以上几点只供参考,要选择合适的展开剂,需要查阅有关资料,另一方面还要通过实验。
3、点样取少量试样,用水或易挥发的有机溶剂(如乙醇、丙酮、乙醚等),将它完全溶解,配制成约1%的溶液。
用铅笔在滤纸上画线,标明点样位置,以毛细管吸取少量试样溶液,在滤纸上按照已写好的编号分别点样,控制点样直径在.0.2~0.5cm。
然后将其晾干或在红外灯下烘干。
4、展开于层析缸中注入展开剂,将已点样的滤纸晾干后悬挂在层析缸内,将点有试样的一端放入展开剂液面下约1cm处,但试样斑点的位置必须在展开剂液面之上。
见图2.10.2所示。
5、显色展开完毕,取出层析滤纸,画出前沿。
另一种方法是先画出前沿,然后展开,但应随时注意展开剂是否已到达画出的前沿。
如果化合物本身有颜色,就可直接观察到斑点。
如本身无色,可在紫外灯下观察有无荧光斑点,用铅笔在滤纸上画出斑点位置,形状大小。
通常可用显色剂喷雾显色,不同类型化合物可用不同的显色剂。
对于未知试样显色剂的选择,可先取试样溶液1滴,点在滤纸上,而后滴加显色剂,观察有无色点产生。
6、比移值(Rf值)在固定的条件下,不同的化合物在滤纸上依不同的速度移动所以各个化合物的位置也各不相同,通常用距离表示移动的位置,见图2.10.3。
比移值的计算如下式:
当温度、滤纸质量和展开剂等都相同时,对于一个化合物比移值是一个特有的常数。
因而可作定性分析的依据。
由于影响比移值的因素过多,实际数据与文献记载不完全相同,因此在测定Rf值时,常采用标准试样在同一张滤纸点样对照。
五、薄层色谱
薄层色谱(薄层层析)是近年来发展起来的一种微量、快速而又简单的色谱法,它兼有柱色谱和纸色谱的优点。
常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
薄层色谱不仅适用于小量样品的分离,也适用于较大量样品的精制。
特别适用于挥发性较小,或在较高温度下容易发生变化而不能用气相色谱分离的化合物。
1、薄层色谱用的吸附剂和支持剂和柱色谱相似,薄层吸附色谱的吸附剂常用的是氧化铝和硅胶。
分配色谱的支持剂为纤维素和硅藻土等。
硅胶是无定形多孔性的物质,略具酸性,适用于酸性和中性化合物的分离和分析。
薄层色谱用的硅胶分为“硅胶H”——不含粘合剂。
“硅胶G”——含煅石膏做粘合剂。
“硅胶HF—254”——含荧光物质,可在波长254nm紫外光下观察荧光。
“硅胶GF—254”——含有煅石膏和荧光剂。
薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G,氧化铝GF-254及氧化铝HF—254。
粘合剂除煅石膏(CaSO4·H2O)外,还可用淀粉、羧甲基纤维素钠。
加粘合剂的薄板称为硬板,不加粘合剂的称为软板。
薄层吸附色谱和柱吸附色谱一样,化合物的吸附能力和它们的极性成正比,具有较大极性的化合物吸附较强,因而Rf值就小。
因此利用化合物极性的不同,将它们分离开。
2、薄层板的制备薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果,薄层应尽可能的均匀而且厚度(0.25~1mm)要固定。
否则展开时溶剂前沿不齐,色谱结果也不易重复。
通常先将吸附剂调成糊状物:
称取约10g硅胶,加蒸馏水20mL,立即调成糊状物。
如采用10g氧化铝则加蒸馏水10mL可涂3cm×12cm三至四片,然后将调成的糊状物采用下列两种涂布方法,制成薄层板。
(1)平铺法:
可将自制涂布器(如图2.10.4,洗净把干净的玻璃板在涂布器中摆好,上下两边各夹一块比前者厚0.25mm的玻璃板,在涂布器槽中倒入糊状物,将涂布器自左向右推,即可将糊状物均匀地涂在玻璃板上。
若无涂布器,也可用边沿光滑的不锈钢尺自左向右将糊状物刮平。
(2)倾注法:
将调好的糊状物倒在玻璃板上,用手摇晃,使其表面均匀光滑。
3、薄层板的活化将涂好的薄层板室温水平放置晾干后,放入烘箱内加热活化,活化条件根据需要而定。
硅胶板一般在烘箱中渐渐升温,维持105~110℃活化30min。
氧化铝板在200~220℃烘4h可得活性II级的薄板。
150~160℃烘4h可得活性III~IV级的薄板。
薄板的活性与含水量有关,其活性随含水量的增加而下降。
氧化铝板活性的测定:
将偶氮苯30mg、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红和对氨基偶氮苯各20mg,溶于50mL无水四氯化碳中,以毛细管吸取少量溶液滴加在氧化铝薄板上,用无水四氯化碳展开,测定各染料的位置,算出比移值,根据表2.10.3中所列的各染料的比移值确定其活性等级。
表2.10.3氧化铝活性与各偶氮染料比移值的关系
活性级别
偶氮染料
勃劳克曼活性级的Rf值
II
III
IV
V
偶氮苯
0.59
0.74
0.85
0.95
对甲氧基偶氮苯
0.16
0.49
0.69
0.389
苏丹黄
0.01
0.25
0.57
0.78
苏丹红
0.00
0.10
0.33
0.56
对氨基偶氮苯
0.00
0.03
0.08
0.19
硅胶板活性的测定:
取对二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝和苏丹红三种染料各10mg,溶于1mL氯仿中,将此混合液滴于薄层上,用正已烷-乙酸乙酯(体积比9:
1)展开。
若能将三种染料分开,并且按比移值对二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝、苏丹红的顺序递减,则和II级氧化铝的活性相当。
4、点样固体样品通常溶解在合适的溶剂中配成1%~5%的溶液,用内径小于1毫米的平口毛细管吸取样品溶液点样。
点样前可用铅笔在距薄层板一端约一厘米处轻轻地划一条横线作为“起始线”。
然后将样品溶液小心地点在“起始线”上。
样品斑点的直径一般不应超过3毫米。
如果样品溶液太稀需要重复点样时,须待前一次点样的溶剂挥发之后再点样。
点样时毛细管的下端应轻轻接解吸附剂层。
如果用力过猛,会将吸附剂层戳成一个孔,影响吸附剂层的毛细作用,从而影响样品的Rf值。
若在同一块板上点两个以上样点时,样点之间的距离不应小于1厘米。
点样后待样点上溶剂挥发干净才能放入展开槽中展开。
5、展开展开剂带动样点在薄层板上移动的过程叫展开。
展开过程是在充满展开剂蒸气的密闭的展开槽中进行的。
展开的方式通常有直立式、卧式、斜靠式、下行式、双向式等。
图2.10.5薄层板在不同的层析缸中展开的方式
直立式展开是在立式展开槽中进行的。
用于含粘合剂的色谱板,将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中。
先在展开槽中装入深约0.5厘米的展开剂,盖上盖子放置片刻,使蒸气充满展开槽。
然后将点好样的薄层板小心放入展开槽,使其点样一端向下(注意样点不要浸泡在展开剂中),盖好盖子。
由于吸附剂的毛细作用展开剂不断上升,如果展开剂合适,样点也随之展开,当展开剂前沿到达距薄层板上端约1厘米处时,取出薄层板并标出展开剂前沿的位置。
分别测量前沿及各样点中心到起始线的距离,计算样品中各组分的比移值。
如果样品中各组分的比移值都较小,则应该换用极性大一些的展开剂;反之,如果各组分的比移值都较大,则应换用极性小一些的展开剂。
每次更换溶剂,必须等展开槽中的前一次的溶剂挥发干净后,再加入新的溶剂。
更换溶剂后,必须更换薄层板并重新点样、展开,重复整个操作过程。
直立式展开只适合于硬板。
卧式展开如图2.10.5
(1)所示,薄层板倾斜15°放置操作方法同直立式,只是展开槽中所放的展开剂应更浅一些。
卧式展开既适用于硬板,也适用于软板。
斜靠式展开如图2.10.5
(2)所示,薄层板的倾斜色度为30°~90°之间,一般也只适合于硬板。
下行式展开如图2.10.5(3)所示。
薄层板坚直悬挂在展开槽中,一根滤纸条或纱布条搭在展开剂和层析板上沿,靠毛细作用引导展开剂自板的上端向下展开。
此法适合于比移值较小的化合物。
双向式展开是采用方形玻璃板铺制薄层,样品点在角上,先向一个方向展开,然后转动90°再换一种展开剂向另一方向展开。
此法适合于成分复杂或较难分离的混合物样品。
用于分离的大块薄层板,是在起点线上将样液点成一条线,使用足够大的展开槽展开,展开后成为带状,用不锈钢铲将各色带刮下分别萃取,各自蒸去溶剂,即可得到各组分的纯品。
6、显色分离和鉴定无色物质,必须先经过显色才能观察到班点的位置,判断分离情况。
常用的显色方法有如下几种:
碘蒸气显色法由于碘能与很多有机化合物(烷和卤代烷除外)可逆地结合形成有颜色的络合物,所以先将几粒碘的结晶置于密闭的容器中,碘蒸气很快地充满容器,此时将展开后的薄层板(溶剂已挥发干净)放入容器中,有机化合物即与碘作用而呈现出棕色的斑点。
将薄层板自容器中取出后,应立即标记出斑点的形状和位置(因为薄板放在空气中,由于碘挥发棕色斑点在短时间内即会消失),计算比移值。
紫外光显色法如果被分离(或分析)的样品本身是荧光物质,可以在暗处在紫外灯下观察到荧光物质的亮点。
如果样品本身不发荧光,可以在制板时,在吸附剂中加入适量的荧光剂或在制好的板上喷上荧光剂,制成荧光薄层层析板。
荧光板经展开后取出,标记好展开剂的前沿,待溶剂挥发干净后,放在紫外灯下观察,有机化合物在亮的荧光背景上呈暗红色斑点。
标记出斑点的形状和位置,计算比移值。
试剂显色法除了上述显色法之外,还可以根据被分离(分析)化合物的性质,采用不同的试剂进行显色,一些常用显色剂及被检出物质列在表2.10.4中。
操作时,先将薄层板展开,风干,然后用喷雾器将显色剂直接喷到薄层板上,被分开的有机物组分便呈现出不同颜色的斑点。
及时标记出斑点的形状和位置,计算比移值。
表2.10.4一些常用显色剂及被检出物质表
显色剂
配制方法
被检出物质
硫酸*
使用20%的硫酸
通用试剂,大多数有机物在加热后显黑色斑点
香兰素-浓硫酸
1%香兰素的浓硫酸溶液
冷时可检出萜类化合物,加热时为通用显色剂
四氯邻苯二甲酸酐
2%四氯邻苯二甲酸酐溶液
溶剂:
丙酮:
氯仿=10:
1
可检出芳香烃
硝酸铈铵
6%硝酸铈铵的2mol/L硝酸溶液
检出醇类
铁氰化钾-三氯化铁
1%铁氰化钾水溶液与2%的三氯化铁水溶液使用前等体积混合
检出酚类
2,4-二硝基苯肼
0.4%2,4-二硝基苯肼的2mol/L盐酸溶液
检出醛酮
溴酚兰
0.05%溴酚兰的乙醇溶液
检出有机酸
茚三酮
0.3克茚三酮溶于100毫升乙醇中
检出胺、氨基酸
三氯化锑
三氯化锑的氯仿饱和溶液
甾体、萜类、胡萝卜素等
二甲氨基苯胺
1.5克二甲氨基苯胺溶于25mL甲醇、25mL水及1mL乙酸组成的混合溶液中
检出过氧化物
*以CMC为粘合剂的硬板不宜用硫酸显色,因为硫酸也会使CMC碳化变黑,整板黑色而显不出斑点位置。
六、实验步骤
1、柱层析
荧光黄和碱性湖蓝BB的分离
(1)
(1)装柱
选择一支15×1.5cm的层析柱,于柱的底
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