核酸讲义.docx

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核酸讲义

第四章核酸化学

要求掌握：

常见核苷酸的种类；DNA双螺旋模型和tRNA的二级结构；核酸的主要理化特性。

熟悉：

核酸研究的主要工具酶类型。

核酸的类别；核酸的生物学功能。

了解：

DNA损伤修复的方式。

核酸的分离原理。

重点内容：

DNA双螺旋模型和tRNA的二级结构；核酸的热变性和紫外吸收性质。

难点内容：

DNA和RNA的结构。

第一节概述

一、染色体是基因的载体

二、因的化学本质是核酸

1、1868年，FMischer从脓细胞核中首次分离出核酸。

2、1944年，OTAvery等通过肺炎双球菌转化实验证生物的遗传物质是DNA

Avery等肺炎双球菌转化实验

3、1952年，ADHershey&MChase通过同位素标记噬菌体感染大肠杆菌实验证明遗传物质是DNA。

32P标记DNA,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞

第二节核酸的分类和组成

一、核酸分为两大类:

脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid

核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid。

（一）核糖核酸（RNA）

•RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。

RNA为单链分子。

根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。

1、mRNA（信使RNA）

•约占总RNA的5%。

•不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。

•它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地–核糖核蛋白体。

2、tRNA（转移RNA）

•约占总RNA的10-15%。

•它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。

•已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。

RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。

3、rRNA（核糖体RNA）

约占全部RNA的80%，

是核糖核蛋白体的主要组成部分。

rRNA的功能与蛋白质生物合成相关。

（二）脱氧核糖核酸（DNA）

DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。

DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。

二、核酸的分布

三、核酸的化学组成

（一）碱基

构成核苷酸中的碱基是含氮杂环化合物，有嘧啶（pyrimidine）和嘌呤（purine）两类。

核酸中嘌呤碱主要是腺嘌呤和鸟嘌呤，嘧啶碱主要是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

DNA和RNA中均含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶，而尿嘧啶主要存在于RNA中，胸腺嘧啶主要存在于DNA中。

在某些tRNA分子中也有胸腺嘧啶，少数几种噬菌体的DNA含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。

这五种碱基受介质pH的影响出现酮式、烯醇式互变异构体。

（二）戊糖

核酸中有两种戊糖DNA中为D-2-脱氧核糖（D-2-deoxyribose），RNA中则为D-核糖（D-ribose）（图3-5）。

在核苷酸中，为了与碱基中的碳原子编号相区别核糖或脱氧核糖中碳原子标以C-1’，C-2’等。

脱氧核糖与核糖两者的差别只在于脱氧核糖中与2’位碳原子连结的不是羟基而是氢，这一差别使DNA在化学上比RNA稳定得多

（三）磷酸

第三节核苷与核苷酸

•核酸

核苷酸核苷+磷酸

戊糖+碱基

核苷酸可分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两类，核糖核苷酸是RNA的构件分子，而脱氧核糖核苷酸是DNA构件分子。

细胞内还有各种游离的核苷酸和核苷酸衍生物，它们具有重要的生理功能。

核苷酸由核苷（nucleoside）和磷酸组成。

而核苷则由碱基（base）和戊糖构成

一、核苷酸的结构---见P143

1、常见核苷的结构

•嘌呤碱基的第9位N与戊糖的第1位C连接；

•嘧啶碱基的第1位N与戊糖的第1位C连接；

2、稀有核苷

在tRNA中含量丰富，是常见核苷酸经修饰生成的。

修饰碱基

修饰核糖

碱基与核糖的连接方式改变

二、核苷酸的性质----见P147

三、核苷酸的重要衍生物

1、能量通用货币----ATP

2、第二信使分子----Camp

3、其他

•调节因子-----Ap4A

•细菌严紧控制因子

--------ppGpp和ppGppp

第四节核酸的结构

一、核酸的一级结构

（一）核苷酸之间的基本连接

-----3’，5’-磷酸二酯键

（二）特征及书写方式

1、特征：

•核酸分子骨架是由3’，5’-磷酸二酯键连接的许多核糖或脱氧核糖组成，在整个分子中不变。

•核酸分子中可变部分是它的碱基顺序。

•分子具有方向性。

通常5’端有游离磷酸，3’端有游离羟基。

2、核酸一级结构的书写方式

（1）线条缩写

（2）字母式缩写

5’ATCGGATTGCAACGCCACGACTATACGGATTGAATTGACGCAATTCGGCAATTGCACAATATCTGCA….3’

千万别小看这四个不起眼的英文字母啊，它们千变万化的排列顺序代表了你的遗传奥秘！

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二、研究核酸的工具酶

核酸酶指所有可以水解核酸的酶。

按照作用底物的不同分：

•DNA酶（DNase）:

水解DNA

•RNA酶（RNase）:

水解RNA

按照作用的部位分：

核酸外切酶：

作用于5′或3′末端；

核酸内切酶：

作用于链的内部

（一）RNase

（二）DNA酶

1、DNaseI:

牛胰脱氧核糖核酸酶，切断双链或单链DNA，产物为5‘-寡核苷酸，平均长度4bp;无碱基专一性。

2、DNaseII：

牛脾脱氧核糖核酸酶，产物为3‘-寡核苷酸，平均长度6bp;无碱基专一性。

如EcoRI：

5’---G↓AATTC---

3’---CTTAA↑G---

如NlaIV：

5’---GGN↓NCC---3’

3’---CCN↑NGG---5’

其中N代表一种核苷酸碱基。

（4）DNA限制性内切酶命名原则

•由分离出酶的微生物的属名第一个字母和种名的前两个字母组成，如Eco（从Esherichiacoli大肠杆中分离出的酶）;Hin（从Haemaphiluinfluenzae流感嗜血菌中分离出的酶）。

•微生物的株和型写在其后EcoRI.

•若从某株中分离得数种酶为HindI.II,III

（三）非特异性核酸外切酶

•既可作用于DNA也可作用于RNA

•牛脾磷酸二酯酶：

产物是3’单核苷酸

•蛇毒磷酸二酯酶：

产物是5’单核苷酸

NNNN

PPPP3’

三、DNA的二级结构

-------Watson-Crik双螺旋结构模型

1953年，J.Watson和F.Crick在《Nature》杂志上发表文章，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。

这项杰出的成就是生命科学发展史上的一个重要里程碑！

（一）DNA双螺旋结构模型提出的两个依据

•MWilkins和Franklin拍摄的对DNA纤维进行X-射线衍射分析的照片。

•EChargaff对DNA碱基组成的定量分析结果。

证明A=T；G=C；A+G=T+C

（二）DNA双螺旋结构要点

（1）DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链围绕同一轴心相互缠绕，形成右手双螺旋。

其中即一条链的方向为5→3'，而另一条链的方向为3′→5′。

（2）嘌呤和嘧啶碱基位于双螺旋内侧,磷酸与脱氧核糖位于双螺旋外侧,彼此通过3‘,5’-磷酸二酯键连接,形成DNA分子的骨架。

碱基环平面与螺旋轴垂直，糖环平面与螺旋轴平行。

（3）碱基互补配对：

两条脱氧核苷酸链之间依靠碱基互补配对形成的氢键连接在一起。

A和T之间形成两个氢键;C和G之间形成三个氢键。

（4）螺旋参数：

双螺旋直径2nm,每螺旋一周包含10个碱基对，螺距（即螺旋旋转一圈高度）为为3.4nm。

（5）螺旋表面:

双螺旋表面有两条螺旋型沟漕，一条较深较宽，称为大沟（宽1.2nm;深0.85nm）；一条较浅较窄，称为小沟（宽0.6nm;深0.75nm）。

（三）DNA双螺旋结构的稳定因素

（1）氢键

（2）碱基堆积力

（3）离子键

（四）DNA双螺旋结构的类型

•A-DNA：

钠盐，制备时相对湿度75%

•B-DNA：

钠盐，制备时相对湿度92%

（细胞内天然构象）

•C-DNA：

锂盐，制备时相对湿度66%

•Z-DNA：

人工合成d（CGCGCG）寡聚核苷酸，为左手螺旋。

因分子骨架上磷酸基排列呈锯齿状而得名，即ZigzagDNA

A-DNAB-DNAZ-DNA

四、DNA的高级结构

（一）DNA三级结构——超螺旋结构

DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。

生物体内有些DNA是以双链环状DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌体DNA，细菌染色体与细菌中质粒DNA，真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA都是环状的。

环状DNA分子可以是共价闭合环，即环上没有缺口，也可以是缺口环，环上有一个或多个缺口。

在DNA双螺旋结构基础上，共价闭合环DNA（covalentlyclosecircularDNA）可以进一步扭曲形成超螺旋形（superhelicalform）（图3-15）。

根据螺旋的方向可分为正超螺旋和负超螺旋。

正超螺旋使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加，而负超螺旋可以减少双螺旋的圈数。

几乎所有天然DNA中都存在负超螺旋结构。

（二）DNA的四级结构——DNA与蛋白质形成复合物

在真核生物中其基因组DNA要比原核生物大得多，如原核生物大肠杆菌的DNA约为4.7×103kb，而人的基因组DNA约为3×106kb，因此真核生物基因组DNA通常与蛋白质结合，经过多层次反复折叠，压缩近10000倍后，以染色体形式存在于平均直径为5μm的细胞核中。

线性双螺旋DNA折叠的第一层次是形成核小体（nucleosome）。

犹如一串念珠,核小体由直径为11nm×5.5nm的组蛋白核心和盘绕在核心上的DNA构成。

核心由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成，为八聚体，146bp长的DNA以左手螺旋盘绕在组蛋白的核心1.75圈，形成核小体的核心颗粒，各核心颗粒间有一个连接区，约有60bp双螺旋DNA和1个分子组蛋白H1构成。

平均每个核小体重复单位约占DNA200bp。

DNA组装成核小体其长度约缩短7倍。

在此基础上核小体又进一步盘绕折叠，最后形成染色体。

五、RNA的二级结构

（一）tRNA

1、tRNA的三叶草结构模型

•多数RNA为单链，但可通过自身回折配对形成部分双链结构；

•tRNA一般由70-90个核苷酸组成；

•常含有稀有碱基。

•1965年，RWHolley阐明酵母丙氨酸tRNA的结构。

tRNA三叶草结构模型

-------见P161

2、tRNA的三级结构

------倒“L”型结构

1973-1974年，SHKim和Robertus根据酵母苯丙氨酸tRNA的空结构提出的。

（二）mRNA结构

-------p161

原核生物中mRNA转录后一般不需加工，直接进行蛋白质翻译。

mRNA转录和翻译不仅发生在同一细胞空间，而且这两个过程几乎是同时进行的。

真核细胞成熟mRNA是由其前体核内不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）剪接并经修饰后才能进入细胞质中参与蛋白质合成。

所以真核细胞mRNA的合成和表达发生在不同的空间和时间。

mRNA的结构在原核生物中和真核生物中差别很大。

下面分别作一介绍：

1.原核生物mRNA结构特点

原核生物的mRNA结构简单，往往含有几个功能上相关的蛋白质的编码序列，可翻译出几种蛋白质，为多顺反子。

在原核生物mRNA中编码序列之间有间隔序列，可能与核糖体的识别和结合有关。

在5’端与3’端有与翻译起始和终止有关的非编码序列（图3-21），原核生物mRNA中没有修饰碱基，5’端没有帽子结构，3’端没有多聚腺苷酸的尾巴（polyadenylatetail，polyA尾巴）。

原核生物的mRNA的半衰期比真核生物的要短得多，现在一般认为，转录后1min，mRNA降解就开始。

2.真核生物mRNA结构特点

真核生物mRNA为单顺反子结构，即一个mRNA分子只包含一条多肽链的信息。

在真核生物成熟的mRNA中5’端有m7GpppN的帽子结构，帽子结构可保护mRNA不被核酸外切酶水解，并且能与帽结合蛋白结合识别核糖体并与之结合，与翻译起始有关。

3’端有polyA尾巴，其长度为20~250个腺苷酸，其功能可能与mRNA的稳定性有关，少数成熟mRNA没有polyA尾巴，如组蛋白mRNA，它们的半衰期通常较短

•

（三）rRNA的结构

-------P162

rRNA占细胞总RNA的80%左右，rRNA分子为单链，局部有双螺旋区域（图3-22）具有复杂的空间结构，原核生物主要的rRNA有三种，即5S、16S和23SrRNA，如大肠杆菌的这三种rRNA分别由120、1542和2904个核苷酸组成。

真核生物则有4种，即5S、5.8S、18S和28SrRNA,如小鼠，它们相应含121、158、1874和4718个核苷酸。

rRNA分子作为骨架与多种核糖体蛋白（ribosomalprotein）装配成核糖体。

所有生物体的核糖体都由大小不同的两个亚基所组成。

原核生物核糖体为70S，由50S和30S两个大小亚基组成。

30S小亚基含16S的rRNA和21种蛋白质，50S大亚基含23S和5S两种rRNA及34种蛋白质。

真核生物核糖体为80S，是由60S和40S两个大小亚基组成。

40S的小亚基含18SrRNA及33种蛋白质，60S大亚基则由28S、5.8S和5S３种rRNA及49种蛋白质组成。

（四）其他RNA分子

20世纪80年代以后由于新技术不断产生，人们发现RNA有许多新的功能和新的RNA基因。

细胞核内小分子RNA（smallnuclearRNA，snRNA）是细胞核内核蛋白颗粒（Smallnuclearribonucleoproteinparticles，snRNPs）的组成成分，参与mRNA前体的剪接以及成熟的mRNA由核内向胞浆中转运的过程。

核仁小分子RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）是类新的核酸调控分子,参与rRNA前体的加工以及核糖体亚基的装配。

胞质小分子RNA（smallcytosolRNA，scRNA）的种类很多，其中7SLRNA与蛋白质一起组成信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）,SRP参与分泌性蛋白质的合成，反义RNA（antisenseRNA）由于它们可以与特异的mRNA序列互补配对，阻断mRNA翻译，能调节基因表达。

核酶是具有催化活性的RNA分子或RNA片段。

目前在医学研究中已设计了针对病毒的致病基因mRNA的核酶，抑制其蛋白质的生物合成，为基因治疗开辟新的途径，核酶的发现也推动了生物起源的研究。

微RNA（microRNA，miRNA）是一种具有茎环结构的非编码RNA，长度一般为20-24个核苷酸，在mRNA翻译过程中起到开关作用，它可以与靶mRNA结合，产生转录后基因沉默作用（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS），在一定条件下能释放，这样mRNA又能翻译蛋白质，由于miRNA的表达具有阶段特异性和组织特异性，它们在基因表达调控和控制个体发育中起重要作用。

（五）RNA组

随着基因组研究不断深入，蛋白组学研究逐渐展开，RNA的研究也取得了突破性的进展，发现了许多新的RNA分子，人们逐渐认识到DNA是携带遗传信息分子，蛋白质是执行生物学功能分子，而RNA即是信息分子，又是功能分子。

人类基因组研究结果表明，在人类基因组中约有30000～40000个基因，其中与蛋白质生物合成有关的基因只占整个基因组的2%，对不编码蛋白质的98%基因组的功能有待进一步研究，为此20世纪末科学家在提出蛋白质组学后，又提出RNA组学。

RNA组是研究细胞的全部RNA基因和RNA的分子结构与功能。

目前RNA组的研究尚处在初级阶段，RNA组的研究将在探索生命奥秘中做出巨大贡献。

第三节核酸的理化性质

一、核酸的大小和水解

一般来说，进化程度高的生物DNA分子应越大，能贮存更多遗传信息。

但进化的复杂程度与DNA大小并不完全一致，如哺乳类动物DNA约为3×109bp，但有些两栖类动物、南美肺鱼DNA大小可达1010bp到1011bp（表3-3）。

常用测定DNA分子大小的方法有电泳法、离心法。

凝胶电泳是当前研究核酸的最常用方法，凝胶电泳有琼脂糖（agarose）凝胶电泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳，

（二）核酸水解

（1）酸碱水解：

核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。

DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。

例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。

在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。

（2）酶水解

水解核酸的酶有很多种，若按底物专一性分类，作用于RNA的称为核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），作用于DNA的则称为脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。

按对底物作用方式分类,可分核酸内切酶（endonuclease）与核酸外切酶（exonuclease）。

核酸内切酶的作用是在多核苷酸内部的3’，5’磷酸二酯键，有些内切酶能识别DNA双链上特异序列并水解有关的3’，5’磷酸二酯键。

核酸内切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有广泛用途。

而核酸外切酶只对核酸末端的3’，5’磷酸二酯键有作用，将核苷酸一个一个切下，可分为5’→3’外切酶，与3’→5’外切酶。

二．核酸的两性性质及等电点

与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也

含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。

由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。

如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。

三、核酸的紫外吸收性质

摩尔磷消光系数å（p）：

指含磷量为1mol/L浓度时的核酸水溶液（Ph7.0）在260nm处的紫外吸收值。

天然DNA的å（p）值为6000-8000；

RNA的å（p）值为7000-10000

增色效应：

指DNA变性或降解时在260nm处紫外吸收值增高的现象。

减色效应：

指DNA复性时在260nm处紫外吸收值减低的现象。

四、核酸的变性、复性与杂交

（一）核酸的变性

1、概念

在变性因素影响下，核酸分子的双螺旋结构解开，氢键断裂（不涉及共价键的断裂），使双链分离，形成单链。

这种现象称为核酸的变性。

核酸的变性与降解完全不同

降解：

是指多核苷酸链中的磷酸二酯键断裂，使分子量降低，其过程是不可逆的。

变性：

不涉及共价键的断裂；一级结构不破坏，一般是可逆的，不发生分子量的变化。

2.引起核酸变性的因素

加热、介质中的pH过酸或过碱、有机溶剂、如乙醇、丙酮、尿素、酰胺等。

3、DNA变性后的表现

260nm处的紫外吸收值升高；粘度下降；沉降速率增高；生物活性降低或丧失

（二）复性

1、概念

变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性（renaturation）。

当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）。

2、影响DNA复性速度的因素

DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：

DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变性，而温度过低可使误配对不能分离等等。

最佳的复性温度为Tm减去25℃，一般在60℃左右。

离子强度一般在0.4mol/L以上。

3、DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关

DNA浓度越大，复性越容易。

将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性。

缓慢冷却时，可以复性。

DNA分子量越大复性越难。

DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。

高度重复序列容易复性，非重复组分复性较慢。

复性反应的速度可以用1/2Cot来衡量

Co------变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示；

t-------复性所需时间，用秒表示；

1/2Cot----表示复性一半时的Cot值

DNA复性越快，1/2Cot值越小

（三）核酸杂交

1、概念

具有互补序列的不同来源的单链核酸分子，按碱基配对原则结合在一起称为杂交（hybridization）。

杂交可发生在DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA之间。

杂交是分子生物学研究中常用的技术之一，利用它可以分析基因组织的结构，定位和基因表达等，常用的杂交方法有Southern印迹法，Northern印迹法和原位杂交（insituhybridization）等。

2、各种杂交

•Southernblotting:

由E.Southern于1975年首次设计使用。

毛细管作用使电泳凝胶中分离的DNA片段转移到滤膜上，再与同标记的单链DNA或RNA探针杂交作用检测之。

•Northernblotting:

由GRStark于1977年建立。

毛细管作用使电泳凝胶中分离的RNA片段转移到滤膜上，再与同标记的单链DNA或RNA探针杂交作用检测之。

•Westernblotting：

利用抗原/抗体特异结合原理，来分析检测蛋白质的杂交技术。

五、核酸沉降作用

--------见P167

六、核酸的研究技术

（一）核酸含量测定-----P178

1、定磷法

2、定糖法

3、紫外吸收法

（二）DNA的凝胶电泳（补充）

1、核酸的凝胶电泳与原理

琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（po1yacrylamide）

凝胶电泳被于核酸分离、鉴定、纯化等研究。

基本原理：

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团，呈离子化状态。

DNA和RNA的多核苷酸链为多聚阴离子。

在电场中向正电极方向迁移。

在一定的电场强度下，不同大小和构型的DNA分子的电泳迁移率不同，因而得以分离。

2、溴化乙锭----核酸分子染色剂

3．琼脂糖与聚丙烯凝胶电泳对DNA的分辨率

琼脂糖：

分辨DNA片段的范围为0．2—50kb之间。

聚丙烯酰胺：

分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。

4、DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率

在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。

•DNA分子量大，迁移率小

•相同分子量DNA分子迁移率与构象有关

第六节核酸的功能

中心法则

复制：

replication，以DNA为模板根据碱基互补配对原则合成DNA的过程。

转录：

transcription，以DNA为模板根据碱基互补配对原则合成RNA的过程。

逆转录：

Reversetranscription，以RNA为模板根据碱基互补配对原则合成DNA的过程。

翻译：

translation,以mRNA为指导，合成蛋白质的过程。

一、DNA是遗传物质