基因工程期末复习考点doc.docx
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浙江万里学院基因工程期末复习考点
第一章绪论
1.分子生物学与基因工程发展的代表性事件:
(客观题)1928年,Griffith实验——肺炎双球菌体内转化实验,证明了转化因子(DNA)是遗传物质,
没有得出蛋白质与遗传物质的关系
1944年,Avery实验——体外转化实验,证实了蛋白质不是遗传物质。
1952年,Hershey-Chase实验一一利用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体的捣碎实验证明了遗传物质是DNA,而不是蛋白质。
1953年,沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构,开启了分子生物学时代。
威尔金斯富
兰克林(填空)
1958年,MatthewMeselsonFranklinStahl采用氯化艳密度梯度离心法验证DNA复制的半
保留复制
MarshallW.NirenbergHarG.Khorana
RobertW.Holley1965年破译了所有氨基酸的密码子
2.镰刀型贫血:
氨基酸突变血红蛋白亚基N端的第六个氨基酸残基是缴氨酸(val),而
不是下正常的谷氨酸残基(Glu)。
tt
GAAGUA
tt
CTT值出|CAT“AA\反rpjAAA
A■'—■A」A
GAA突变GTA
嫌刀型细胞贫血控必因的图解
3.胰岛素(公司+事件)
1921年,加拿大科学家Banting和Best发现胰岛素,是糖尿病治疗史上的里程碑
1922年,开始用于糖尿病的治疗
胰岛素发现四人组”:
Banting、Best、科利普和麦克莱德
1922年5月,多伦多大学与礼来公司(EliLillyandCompany)it成协议,由科学家们帮助礼来开展胰岛素的规模生产。
因苏林:
第一支商业化胰岛素的诞生
1982年5月14口,礼来向美国FDA提交了生物合成人胰岛素NDA18-790的申请
1982年10月28日,FDA发布了批准书,第一支基因重组人胰岛素正式上市
1997年,第一支基因重组人胰岛素进入中国
Sanger测序法:
蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的
中国科学家的贡献:
人工合成牛胰岛素
1973年,斯坦福大学的StanleyCohen和加州大学旧金山分校的HerbertBoyer合作发表了一篇学术论文一一重组DNA技术
4.1990年,美国批准了第一例临床基因治疗申请,患者为四岁女孩AshantideSilva,由于缺乏腺苜脱氢酶ADA基因而患有严重综合性免疫缺陷症,研究者W.F.Anderson将ADA基因导入患者的淋巴细胞,然后将经改造的淋巴细胞回输到患者体内,取得了成功。
5.HIV被治愈唯一成功的例子:
柏林病人
6.基因编辑技术:
ZFN锌指核糖核酸酶、TALEN转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9
第二章基因操作的工具酶
L限制性核酸内切酶的作用:
能在特异位点(酶切位点)上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段
切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱,具有重大应用价值(分子手术刀)
2.细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶,其作用特点是:
(知道)
特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)
I类限制酶随机切割双链DNA分子,II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列
3.核酸工具酶分类:
核酸水解酶类:
核酸内切酶、核酸外切酶
(填空)核酸合成酶类:
DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA连接酶
核酸修饰酶类:
甲基化酶、核甘酸激酶、核昔酸转移酶、磷酸酶
4.常用的工具酶(客观)
工具酶类
功能
限制性核酸内切酶
特异性识别和切割DNA
T4DNA连接酶
生成3'-5’磷酸二酯键
DNA聚合酶I(Klenow片段)
探针标记、补平浸末端
反转录酶
cDNA合成
多聚核昔酸激酶
5'磷酸化、探针标记
末端脱氧核苜酰转移酶
3'末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
TaqDNA聚合酶
DNA合成、PCR
5.载体的3个特点(功能元件)
6.一种限制酶只能识别一种特定的核昔酸序列,并在特定的切割点上将DNA分子切断
7.分子剪刀——限制性内切酶
%1分布:
主要在微生物中
%1作用特点:
专一性:
一种限制酶只能识别一种特定的核苻酸序列,并且能在特定的切点
上切割DNA分子
多样性:
限制酶有200多种
%1结果:
产生黏性末端或平末端(填空)
8.判断粘性还是平末端
9.限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制一修饰系统
5':
||["AA丁TC
》TAAG
EcoRI
IEcoRI
.「
'—1「
1限制:
作用
|修饰作用]
S'[|5f/XATTCII|i|3"5’yrInIi^AaJ"TC—rrT-rrS'
3。
「TAA5*3'(31JJJJ5>3,Il山1[5T・ViG、n【’’3,
EcoRI
T1
10.内切核酸酶分为三类:
即I型、II型、hi型酶,通常所用的限制性内切核酸酶是指II型
表2.1限制性内切核酸酶类型及主要特性
特性
I型
11型
皿型
限制和修饰活性
双功能的酶
核酸内切酶和
甲基化酶分开
双功能的酵
桐市rfqZ¥TkH
3种不同的亚基
单一亚基
两种不同的亚基
限制作用所需的辅助因子
ATP、Mg2*
Mg2*
ATP、Mg2+
特异性识别位点
非对称序列
回文对称结构
非对称序列
切割位点
在距识别位点至少lOOObp的地方随机的切割
位于识别位点上
距识别位点下游24~26bp处
序列特异的切割
不是
是
是
在基因工程中的应用
无用
广泛使用
用处不大
11.采用Smith和Athens提议的方案,根据限制性内切核酸酶来源和菌株命名(选择判断)
a)
b)
c)
d)
e)
Eg.Hind
用来源细菌的英文缩写斜体符号命名
它的第一个字母大写,来源细菌属名的第1个字母
第二、三字母小写,来源细菌种名的头2个字母
第四个字母代表菌株
最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号
III代表从流感噬血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分离到的第3个限制酶
12.不同限制性内切酶切割的三种结果:
(填空)
a.产生5'突出粘性末端cohesiveend(EcoRI)
5'G|AATTC3'5'pohAATTC3'
3'—-CTT叫G一-5'EcoRI3'—-TTA&hpG---5'
b.产生3'突出粘性末端(PstI>BamHI)
c.产生平末端bluntend(NruI)
13.同尾酶(判断题)BamHI和Bglll,SalI和XhoI
14.限制性内切核酸酶Hpall和Mspl是同位酶,切割同样的DNA序列CCGG,但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应
Mspl切割所有状态下的CCGG序列,而Hpall仅切割非甲基化的CCGG序列。
这样Mspl被用来识别所有的CCGG序列,而Hpall能用来确定是否甲基化
15.影响内切酶酶切反应的条件(简答,如何调整)
%1温度:
一般37°C
%1盐离子浓度:
Na+,Mg2+
%1缓冲体系:
具有稳定pH环境的Tris-HCI缓冲体系,DTT用于保持酶稳定性和活性
%1反应体积和甘油浓度:
商品化的限制性内切核酸酶均加50%甘油作为保护剂,一般在-20°C保存。
酶切反应时,加酶的体积一般不超过总反应的10%,否则甘油浓度过高,影响酶切反应
%1反应时间:
通常为lh;(不超过4h,否则产生非特异性结合,HF-高保真酶)进行大
量DNA酶切反应时一般让酶解过夜
%1DNA纯度和结构:
一个酶单位定义:
lh内完全酶解lMgX噬菌体DNA所需的酶量DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度;酶切的底物一般为双链DNA,DNA的甲基化位置(用甲基化酶切割)会影响酶切反应
评估DNA是否满足酶切条件:
跑胶看下面有没有亮条带
酶切反应注意事项:
价格昂贵;决不能用水稀释,以免变性失活;预先加入除酶以外的所有其他试剂;取酶立即放于冰上。
分装小份避免反复冻融;使用无菌的新吸头;少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10%,否则酶液中的甘油会抑制酶活性
16.“星”活性产生非特异性切割
17.DNA连接酶:
催化DNA上裂口两侧(相邻)核苜酸裸露的3'羟基和5’磷酸之间形成共
价结合的磷酸二酯键(梯子的扶手),不是狙键(梯子的踏板)),使断开的DNA裂口连接起来(填空)
结果:
使粘性末端(平末端)连接起来,粘性末端效率高(判断题)
18.DNA连接酶的作用过程(简答)
1)连接酶与辅助因子ATP或NAD+形成酶-AMP复合物
2)AMP作用于DNA缺口的5'-末端磷酸基团
3)缺曰3'-0H对活跃的磷原子作亲核攻击,形成新的磷酸二酯键,封闭切口
19.DNA连接酶的反应条件
连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。
多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15°C以下,然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37°C但在该温度下,粘性末端之间的氢键结合是不稳定的,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷,所以连接反应一般采用16°C过夜
20.平末端DNA片段的连接(了解,客观)
a)直接用T4DNA连接酶连接:
效率不高,较少采用
b)同聚物连接平末端DNA片段:
先用末端核昔酸转移酶,给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接
c)用衔接物连接平末端DNA分子:
目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点,经酶切后产生特异的粘性末端,从而与具有互补末端的DNA连接
21.重组DNA实验的一般程序(掌握)
1)
选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶(如EcoRI)作位点特异的切割,形成全长的具粘性末端的线性DNA分子
2)
3)
再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化
混合,加入DNA连接酶。
由于具有相同的(如EcoRI)粘性末端,能退火形成双链结合体。
其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后,便产生稳定的杂种DNA分子
22.碱性磷酸酶(修饰酶):
预先处理质粒载体,防止环化(知道)
功能:
催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5'端磷酸基团,从DNA片段上除去5'磷酸以防自身连接
用途:
在用Y-P32磷酸和多核昔酸激酶在5'端标记DNA或RNA之前,进行碱性磷酸酶处理;在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。
23.磷酸激酶(了解)
对核酸末端羟基进行磷酸化的酶,用途:
①放射性标记DNA链的5'末端,探针标记;②Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析;使缺少5'磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化特性:
①该酶很难纯化,酶制品经常不纯;②铉离子是该酶的强烈抑制剂;③低浓度的磷酸也可抑制该酶活性
24.末端脱氧核昔酸转移酶(了解用途)
来源:
小牛胸腺
功能:
在一定条件下,催化将一个一个的脱氧核昔酸,沿着5'3'加到DNA链
的3'-0H末端。
该过程不需要DNA模板,对双链、单链DNA都适用。
经常用于人工粘性末端的构建
25.甲基化酶(了解)
甲基化:
能识别限制酶识别的序列,识别顺序中的某个碱基发生甲基化(常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰),属修饰酶类。
经修饰的DNA不再被限制酶降解
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)来完成的。
甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序
真核生物中目前只发现5甲基胞H密嚏(M5C)
第三章载体
1.载体:
携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子。
2.质粒:
是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。
3.噬菌体载体:
为线性双链DNA分子,全长48.5kb,DNA两端各有一个互补单链的抽性末端,能通过碱基互补作用形成环状DNA分子。
粘性末端形成的双链区域称为cos位点,它是包装蛋白的识别位点。
4.粘粒:
又叫柯斯质粒(Cosmid)载体,是指带有粘性末端位点的质粒。
它是一种由人工构建的含有X噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,在结构组成上具有噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力,一般可插入35~40kb的外源基因。
是构建真核生物基因文库的主要载体
5.人工染色体载体:
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。
主要有酵母人工染色体(YAC)及细菌人工染色体(BAC)o
6.细菌人工染色体(BAC):
是基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
7.酵母人工染色体(YAC):
载体是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。
是最早构建成功的人工染色体克隆载体。
8.报告基因:
在转基因的研究中,常常在载体上重组选择标记基因,通常称为报告基因,在一定的选择压力情况下,利用报告基因在宿主细胞内的表达,达到筛选转化子的目的。
9.载体按作用分类:
克隆载体,表达载体,穿梭载体。
10.各种DNA载体比较(掌握)
类型
最大插入尺寸(kb)
应用
局限性
质粒
6-12
DNA克隆、亚克隆,表达
限制插入片段、蛋白表达,复制收到限制
黏粒
35
cDNA和基因组文库
蛋白表达不理想,噬菌体填充受限,哺乳动物细胞不能复制
H菌人工染色体(BAC)
300
基因组文库,大片段DNA
细菌复制收到限制,不能用于蛋白质的表达
3母人工染色体(YAC)
200-2000
基因组文库,大片段DNA
必须在酵母中生长
Ti质粒
各种类型
植物中基因的转移
只能在植物细胞中,限制性位点随机分布,尺寸大难以操作
11.质粒载体的修饰改造(了解):
%1去掉不必要的DNA区域,只保留质粒复制必须部分,以提高外源DNA装载量
%1减少质粒内限制性内切酶位点,质粒酶切位点过多,给克隆外源DNA造成不便
%1加入选择性标记:
通过质粒间的重组使质粒携带合适标记,常用的有抗生素抗性标记。
如:
氨茉青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
%1安全性能改造:
不能随便转移,以免污染环境
%1改造或增加基因表达的调控序列:
比如加入强启动子
12.发展概况(看一下即可)
第一阶段(1977年前):
天然质粒和重组质粒的利用,如pSClOl,colEl,pCR,pBR313和pBR322
第二阶段:
增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。
如pUC系列载体
第三阶段:
完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含
T3,T7,sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体
13.pBR322
分子量小(4.3kb)、拷贝数高、含四环素和氨茉青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性内切核酸酶仅有一个切割位点。
14.pUC载体的三个显著特点:
(1)分子量更小,仅为2.7KB,容纳外源DNA量增大;具有更高的拷贝数(每个细胞含500-700个拷贝)
(2)含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZa,可利用互补原理进行蓝白筛选
(3)多克隆位点区(MCS)由人工合成的多个单一酶切位点构成
其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同,可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体,进行DNA测序和体外突变等研究。
15.蓝白斑筛选原理:
pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码3-半乳糖昔酶N端146个氨基酸的序列(«•互补肽)的DNA序列(标记为lacZ'),多克隆位点就存在于lacZ'上,B.半乳糖甘酶的C■半乳糖
昔酶)结合才会形成一个有活性的0■半乳糖昔酶。
(这种机制称为a■互补作用)X-gal作为P■半乳糖昔能的指示剂。
在诱导物IPTG存在下,8■半乳糖昔酶催化X-gal形成蓝色化合物,导致菌落呈现蓝色。
在多克隆位点中插入外源DNA,打断半乳糖昔酶的部分基因,不再产生。
.肽链,就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的8.半乳糖昔酶,结果X-gal保持无色,菌落呈白色。
16.噬菌体载体:
入噬菌体可以容纳较大的目的基因。
例如用置换法可去掉长达20kb的XDNA,换入相应长度的目的基因。
基因文库构建常使用X载体。
17.入噬菌体入侵E.coli后,可选择进入裂解生长状态(烈性噬菌体)或溶源状态(温和噬菌体)。
在进入溶源状态时,环状的A噬菌体基因组DNA与宿主DNA在附着位点上发生联会、断开、交换并重新组合,整个XDNA整合到宿主的染色体DNA±成为原噬菌体。
这种情况下,只有cl基因得以编码表达阻遏蛋白,其可以使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性。
故不会繁殖裂解细菌。
18.入噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程,诱导的因素可能很多,实验室常用的是热诱导:
在低温时(30°C)建立溶原,用高温(4200则出现裂解,这种方法称为热诱导表达,使用的是温敏开关。
19.XDNA载体的构建:
1.缩短长度;2.删除重复的酶切口;3.加装选择标记。
20.X噬菌体载体分类:
%1插入型载体:
仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点,如人gt系列。
%1替换型载体:
具有两个对应的酶切克隆位点,如Charon4.EMBL4、EMBL3。
21.表达载体特点:
①具有克隆载体所具有的基本特性;②具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件:
启动子,核糖体结合位点,转录终止序列。
22.原核生物表达载体三个重要原件:
夏制原点、多克隆位点、终止子。
23.启动子:
大肠杆菌表达载体中常用的启动子:
(1)trp-lacjn动子(又称tac启动子)
tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子,由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。
受lac阻遏蛋白的抑制,异丙基硫代半乳糖甘的诱导表达。
(2PL启动子
特点:
受温度的控制,低温(37°C)下被阻遏而抑制,高温(42°C)下去阻遏而激活
(3)T7噬菌体启动子
24.SD序列称为核糖体结合位点。
25.高效表达策略:
SD序列域密码子的距离
原核序列融合表达(密码子优化)
减轻宿主代谢负担:
生长于表达阶段分开,蛋白分泌
26.原核表达系统:
大肠杆菌、枯草芽艳杆菌等。
27.穿梭载体:
能在两种不同的生物中复制的载体,能在原核和真核生物中笈制。
(通常穿梭载体在细菌中用于克隆和扩增克隆基因,在真核细胞中用于基因表达分析)
28.真核表达载体启动子:
诱导型:
AOX:
醇氧化酶(最强启动子)
MOX:
醇氧化能
PHO:
温度诱导(23度表达)
GAL(半乳糖诱导)
组成型:
GAP(甘油醛.3.磷酸脱氢酶)
TEF1(延长因子)
ADH(乙醇脱知酶)
29.酵母表达系统:
酿酒酵母,甲醇酵母,克鲁维酵母,汉逊酵母
30.酿酒酵母:
1安全性
2遗传背景清楚
3DNA导入方便
4易于高密度发酵
5翻译后修饰
甲醇毕赤酵母:
1生长迅速
2pAOXl强启动子
3可诱导表达
31.分泌信号肽:
MF・a:
性结合因子,含88个氨基酸,效率高。
PHO5:
酸性磷酸酯酶
SUC2:
蔗糖酶
KIL:
杀手毒素因子
保守性低,通常不能再宿主间通用
32.翻译后糖基化修饰:
Asn・X・Ser/ThrN.糖基化:
天门冬酰胺上的酰胺氮进行糖基化
O-糖基化:
苏/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化(甘露糖)
33.hisLMut+:
his4■:
组敏酸缺陷型;
Mut+:
有pAOXI,pAOXII启动子;
Muf:
无pAOXI,pAOXII启动子;
Muts:
只有pAOXII启动子。
34.重组方式:
整合方式1:
插入。
如AOX位点、His4位点插入;
整合方式2:
发生多次重组;
整合方式3:
替换。
35.真核表达策略
%1提高转录水平(启动子);
%1信号肽;
%1基因剂量(基因拷贝数);
%1整合位点;
%1发酵条件(培养基成分、pH、溶氧、消泡等):
%1表达产物的稳定性(蛋白酶缺陷菌株、降低pH、竞争性抑制)。
36.昆虫植物等表达载体(了解)
自己了解一下PPT,内容太多就不详细列出,看着心烦。
Ti质粒:
Ti质粒具有五个主要功能区域:
T-DNA、质粒转移、冠瘦碱代谢(opinecatabolism)复制原点(ori)和毒性区域(vir)。
T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列,仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复,右端的序列称为右界(RB),左端的为左界(LB)oT-DNA区域内的所有基因与转移无关,所以将致瘤基因全部缺失后,将其它序列插入到这个区域,形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
第四章分子克隆
早期基因分离方法中利用理化方法分离基因:
密度梯度超速离心法(了解)
2逆转录法的过程(知道)
分离和纯化目的基因mRNA,反转录成cDNA,其程序:
①总RNA的提取:
选择富含某种特异mRNA的组织细胞
细胞内RNA的组成和含量:
DNA
95%核内
5%细胞器
RNA
10%核内
15%细胞器
75%细胞质
80-85%rRNA
10-15%tRNA
1-5%mRNA
b.真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法
3'端具多聚A尾端序列,可利用多聚T为引物与其配对
%1mRNA的分离与纯化
a.poly(A)RNA的分离:
柱层析
b.mRNA的分级:
密度梯度离心或电泳
%1mRNA转译活性的鉴定:
通过转译系统检测基因产物
%1逆转录合成双链cDNA
cDNA第一链的合成:
一次好的逆转录反应可使寡聚(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝
cDNA第二链的合成
%1cDNA克隆,将重组体导入细菌细胞
注:
没有多聚A尾端序列的RNA分子,可用寡聚六甘酸(hexamer)为引物合成第一条链
3文库构建(知道)
基因组文库的构建
1.供体生物基因组DNA的制备,尽量提取大分子量的比较纯合的基因组DNA
2.限制性核酸内切酶部分酶切后,分离选择具有一定长度(15-20kb)的DNA片段
3.在体外将代表该生物完整基因组的所有DNA片段与合适的载体连接成重组分子
4.根据所用载体,选择相应的宿主细胞(大肠杆菌)
5.导入受体细胞
6.
cDNA文库构建
1.分离细胞总RNA,然后利用真核mRNA分子的如端多聚A结构将mRNA从tRNA和rRNA中分离出来
2.以mRNA为模板逆转录合成cDNA第一条链
3.合成cDNA第二条链有两种方法:
一是用大肠杆菌的RNaseH切割RNA-DNA杂交分子产生RNA短片段,DNA聚合酶I以RNA短片段为引物合成新的DNA链;二是利用cDNA第一链的
3,端出现的发夹环结构,即第一链末端返折为合成cDNA第二条链提供引物
4.这些体外合
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