食品检验工大肠菌群教案.docx

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食品检验工大肠菌群教案

广东食品药品职业学院教学教案

（2012～2013学年第二学期）

课程名称

食品检验员职业资格考证

实训项目

黄酒中大肠菌群测定

检验工考证简解、单项技能训练

课时

16

教学对象

11食品检测

授课日期

2013.05

教材

GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定

教师姓名

陈琼

教学方法

演示法、练习法

实验形式

2人一组

实验实训中心签字

实训目的

1．了解黄酒中大肠菌群的测定原理。

2．学习并掌握黄酒中大肠菌群的检测方法。

3．巩固微生物接种与分离技术，细菌染色技术。

教学内容与要求

1．培养基的配制及实验材料准备。

2．供试液的制备。

3．发酵管的接种。

4．分离培养。

5．染色试验等

重点难点

1．供试液的稀配。

2．大肠菌群计数方法。

仪器

天平、称量纸、药匙、精密pH试纸、量筒、试管、锥瓶、玻璃棒、烧杯、10ml、1ml吸量管、试管架、棉花、线绳、报纸、灭菌锅等、擦镜纸、吸水纸等。

试

剂

乳糖胆盐培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰培养基、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、蒸馏水、革兰氏染色试剂、香柏油、二甲苯。

菌种：

大肠杆菌斜面培养物

教

学

过

程

设

计

教

学

过

程

设

计

教

学

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学

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[板书]一、实训目的讲解

1.了解黄酒中大肠菌群的测定原理。

2.学习并掌握黄酒中大肠菌群的检测方法

[板书]二、实训原理讲解

大肠菌群是指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气需氧及兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。

由于来源粪便，所以作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，作为食品卫生检验的指示菌。

食品中大肠菌群数是以100ml检样中大肠菌群最近似或最可能数（MPN）表示的。

三、实训材料及器具（每组）

材料：

乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基，伊红美蓝琼脂培养基,革兰氏染色试剂，液体石蜡，黄酒等

器具：

显微镜1台，酒精灯1只，接种环1根，载波片2-3片，大试管23支，短杜氏小管18支，刻度吸管1ml8支，10ml1支，25ml1支，500锥形瓶1个，250锥形瓶1个，培养皿10套，300ml烧杯1个，玻璃棒1支。

[板书]四、实训步骤及操作讲解

（一）稀释液配制：

（每组用量）（第一天上午）

称取氯化钠2.7克蒸馏水300ml

配制生理盐水300ml，分装到500ml锥形瓶一个，内装量225ml，大试管3支（9ml），加塞包扎，灭菌,备用。

（二）培养基的配制（每2组用量）（第一天上午）

1．制备乳糖胆盐培养基（200ml）：

取乳糖胆盐培养基6克，加入蒸馏水200ml搅拌加热煮沸至完全溶解，分装18支大试管，10ml/支，每支并加入一支倒置的杜氏小管，加塞包扎，灭菌备用。

2．制备伊红美蓝琼脂培养基（200ml）：

取伊红美蓝琼脂培养基7.6克加入蒸馏水200ml搅拌加热至完全溶解，平均分装到2个250ml锥形瓶，加塞包扎，灭菌备用。

3．制备乳糖发酵培养基（200ml）：

取乳糖发酵培养基7克，加入蒸馏水200ml搅拌加热至完全溶解，分装18支大试管，10ml/支，每支并加入一支倒置的杜氏小管，加塞包扎，灭菌备用。

（三）仪器包扎：

（每组用量）（第一天上午）

培养皿6套，刻度吸管1ml6支，25ml1支，灭菌备用。

（四）测定

1．样品稀释处理：

（第一天下午）

用25ml灭菌吸管吸取25ml黄酒，加入225ml灭菌生理盐水制成1：

10稀释液。

再用1ml灭菌吸管取制备好的1：

10稀释液1ml，加入9ml灭菌盐水制成1：

100稀释液，依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。

2．乳糖发酵试验：

（第一天下午）

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度（10-1、10-2、10-3），接种乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种三管。

每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）置36±1℃培养24±2小时，如果所有发酵管都不产气，记录大肠菌群阴性，如有产气按下列程序进行。

3．分离培养（第二天下午）

将产气管接种伊红美蓝琼脂培养基36±1℃培养18-24小时。

然后观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。

大肠菌群可疑菌落的特点是：

①．深紫黑色，具有金属光泽的茵落；

②．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；

③．淡紫黑色，中心色较深的菌落。

4．证实实验：

（第四天下午）

在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1-2个进行革兰氏染色。

镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落片的—部分，接种乳糖复发酵管，置（36±1）℃恒温箱内，培养（24±2）h，观察产气情况。

凡乳糖发酵管产酸产气，证实有大肠菌群存在，即可报告为大肠菌群阳性。

涂片染色流程：

挑取可疑菌落涂片→干燥→固定→初染（草酸铵结晶紫、50s）→水洗→媒染（卢戈氏碘液、lmin）→水洗→脱色（95%的乙醇、20～30s）→水洗→复染（番红液2min）→水洗→晾干→镜检。

（1）涂片

取洁净无油的载玻片，将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后,用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上，并涂抹成直径1.5cm左右的菌膜

（2）干燥

涂片最好在室温下自然干燥。

也可以将涂面朝上在酒精灯上方利用热气烘干,也可用吹风机吹干。

（3）固定

让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外焰来回通过三次，即为固定。

（4）初染

滴加草酸铵结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于涂面上，染色50s ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的积水甩干。

（5）媒染

用卢戈氏碘液媒染约lmin ，水洗。

（6）脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管连续滴加95%的乙醇通过涂面脱色20～30s，至玻片下端流出的乙醇无色时，立即水洗，将载玻片上的积水甩干。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是操作的关键环节。

（7）复染

在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。

在染色的过程中，不可使染液干涸。

（8）晾干

甩去载玻片上的积水，自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以

（注意：

勿直接擦菌膜）。

（9）镜检

涂片必须完全干燥后才能镜检。

先用低倍镜找到物像，并将物像调到视野中央，后用油镜，于标本上滴一滴香柏油，置于油镜下进行观察。

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。

（10）实验结束后处理

清洁显微镜。

先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。

擦镜头时向一个方向擦拭。

显微镜清洗干净，复原，签仪器使用登记本，让老师检查，签名，放回箱子。

染色载玻片用洗衣粉水清洗，晾干后备用。

黄酒中大肠菌群测定（乳糖胆盐培养基接种）

25ml黄酒

各管1ml

35-37℃

培养24±2h

[板书]五、实验结果与分析（报告）（第五天下午）

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

实验报告记录模板

检品名称：

批号：

规格：

检验日期：

报告日期：

凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。

接种量

管号

发酵反应结果

有无典型菌落

革兰染色结果

复发酵反应结果

阳性管数统计

1

1

2

3

2

1

2

3

3

1

2

3

根据证实实验结果，查MPN表，结果报告<每100ml（g）>大肠菌群最可能数

注：

+表示阳性；-表示阴性

[板书]六、检验工考证简解（第一天上午或第四天上午）

1.准备、检测

注：

实验前要注意填写好考官给的评分表，接着开始做实验前要先消毒手和桌面，用消毒棉球。

（注意考试做到10-2稀释级）

a）用25ml吸量管吸取25ml黄酒（考试用水样）放到装有225ml的生理盐水的锥瓶中混匀，制成10-1的稀释级；

b）用1ml灭菌吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml的生理盐水的试管里，振摇混匀即得10-2的稀释级，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管；

c）选择三个稀释度（10-1、10-2、10-3），接种乳糖胆盐发酵管（考试时是水），每个稀释度接种三管。

每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）；

2.革兰染色镜检：

从老师已经培养好的EMB平板培养物中挑取2-3个菌落进行镜检（做2-3张片）

革兰氏染色法：

涂片→干燥→固定→结晶紫初染（50s）→水洗→卢戈碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脱色（20-30s）→水洗→番红复染（2-3min）→水洗→干燥→镜检（油镜观察）。

在油镜头下观察到的结果要让考官看并打分。

3.结果报告：

（用表格来填写）

根据老师提供的已培养好的乳糖胆盐发酵管的情况进行记录，报告。

凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。

4.评分标准

考核要素

评分要素

配分

评分标准

取样量

9管3个浓度的选取稀释与样品中和

8分

浓度稀释与中和正确（7-8分）

稀释基本正确（4-6分）

不正确（3分以下）

基本操作

无菌操作

8分

无菌操作正确（6-8分）

基本正确（4-5分）

不正确（3分以下）

染色涂片

10分

正确、熟练、清晰（8-10分）

基本正确、较熟练清晰（5-7分）

不熟练、染色效果较差（4分以下）

显微镜的使用

8分

熟练、正确（7-8分）

基本正确、较熟练（4-6分）

找不到视野（3分以下）

试验结果

试验结果与报告

6分

结果正确、报告清楚（5-6分）

结果不正确（4分以下）

5.注意事项：

大家可以看检验标准，要熟悉整个检验程序，记住操作步骤，注意无菌操作的要求，熟悉吸量管的使用，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管。

6.考核结束后

每个同学要把用过的器具洗干净（平板培养物不能洗），同时在大锥瓶装约225ml自来水放回原位；桌面收拾干净。

[板书]七、单项技能操作训练（第一天上午或第四天上午）

学生根据的实际情况自由练习显微镜的使用、革兰染色、样品稀释。

考试实验结果记录表

学校（单位）：

姓名：

准考证号：

食品（黄酒）中大肠菌群测定

检品名称：

批号：

规格：

检验日期：

报告日期：

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

一、检验程序

二、检验镜检结果记录及报告

1、乳糖发酵试验

阳性管数

10-1×3

10-2×3

10-3×3

2、革兰氏染色

项目

菌落1

菌落2

菌落3

形状

颜色

结果判断

3、MPN结果报告

检验项目

单位

标准值

实测值

判定

大肠菌群MPN

MPN/100ml

注

意

事

项

1.整个检验过程要注意无菌操作。

2.注意及时记录实验结果和现象。

3.革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。

染色过程勿使染料干凅。

水洗时，水流不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落，一般以冲洗下来的水基本无色为度。

预

习

思

考

题

1.自己查阅国标，熟悉整个检验过程，并注意整个操作过程的无菌操作。

2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？

其中最关键的环节是什么？

主要有两点：

A、革兰染色G+菌培养12～18h为宜,菌龄太老，因菌体死亡或自溶常使阳性菌呈阴性反应。

B、革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。

其中最关键的环节是酒精脱色的时间要控制好

课后记