生物化学实验氨基酸分析实验报告.docx

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生物化学实验氨基酸分析实验报告

实验名称

（TitleofExperimetn）

氨基酸薄层层析

实验日期

（DateofExperiment）

实验地点（LabNo.）

合作者（Partner）

指导老师（Instructor）

总分

（TotalScore）

XX

教师签名（Signature）

李某某

批改日期

（Date）

【实验报告第一部分（预习报告内容）：

实验原理、

实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、

实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：

XX】

一、预习报告

Ø实验原理：

层析（chromatography）：

利用混合物各组分物理化学性质的差异，将多组分混合物进行分离及测定的方法。

固定相（stationaryphase）

层析体质的一个基质。

能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。

流动相（mobilephase）

在层析过程中推动固定相上贷分离的物质朝着一个方向运动的液体或气体。

迁移率（rateofflow，Rf）

一定条件下，在特定时间内某一组份在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，Rf值≤1。

层析原理：

层析体系由一个固定相和一个流动相组成。

流动相对固定相做相对运动，从而推动待分离的混合物样品通过固定相向前移动。

样品中各组份物理化学性质不同，与两相发生相互作用的能力不同，被流动相推动前进时受到的阻力和移动速度不同，一定时间后，不同组份就可以在固定相上分离。

根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。

薄层层析是在玻璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。

薄层层析（thinlayerchromatography，TLC）：

是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。

并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。

本次实验：

●具体原理：

当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

●吸附剂（固定相）：

硅胶（C.P.）。

为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。

●展开剂：

正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:

10:

10,V/V/V）。

●展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。

●活化（activation）：

在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。

可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。

●氨基酸与茚三酮的显色反应：

茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

●Rf值：

由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

Ø实验材料：

●样品：

1、0.01mol/L丙氨酸;

2、0.01mol/L精氨酸;

3、0.01mol/L甘氨酸;

4、混合氨基酸溶液。

●试剂：

1、硅胶（C.P.）

2、0.5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）

3、层展-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀的展开剂（正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:

10:

10,V/V/V））和0.1%茚三酮溶液。

●仪器及器材：

1、层析版（6cm×15cm）

2、小烧杯

3、量筒（10ml）

4、刻度尺

5、铅笔

6、毛细玻璃管

7、层析缸

8、烘箱

9、天平

10、药匙

Ø实验步骤：

●实验流程：

●操作步骤：

步骤

操作

（1）制板

①调浆：

称取硅胶3g，加入0.5%羟甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状

②涂布：

取洁净的干燥玻璃板涂层并涂抹震荡均匀

③干燥：

将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然晾干至表面没有明显水渍

④活化：

70°C烘干60min

（2）点样

①标记：

用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。

每个样品间相距1cm

②点样：

用毛细玻璃管分别吸取0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。

加样原点扩散直径不超过2mm

（3）层析

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。

盖好层析缸盖，上行展层。

当层展剂前沿到达薄板二分之一时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂的前沿界线。

（4）显色

90℃下烘干30min，即可显出各层斑点

●注意事项：

1、玻璃板要清洁平整无油污；2、去掉玻璃板侧缘的硅胶粉，否则层析时会有较强的边缘效应；3、点样时轻触疾起，避免重复点样和斑点过大产生交叉和拖尾；4、毛细玻璃管用完放回原来的烧杯里；5、避免用手接触层析板，避免用手握层析板的下半部分；6、层析板放入层析缸时底端应放置水平，以防倾斜放置使展层方向与薄板下缘不垂直，不好处理数据；7、样点不能浸入到溶液中；8、层析缸盖应作密封处理防止挥发。

【实验报告第二部分（实验记录）：

主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；

实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；

原始实验数据。

评分（满分20分）：

XX】

二、实验记录

（一共做了两组实验，以作对照）

Ø主要实验条件：

●材料：

1、硅胶（C.P.）

2、玻璃板。

要求干净干燥。

●试剂：

1、0.5%的羧甲基纤维素钠8ml

2、0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸溶液。

各取毛细管2cm高左右，扩散不超2mm

3、展层-显色液，层析缸内深度1-2cm

●操作要点：

1、制板时，尽量快地将混合匀浆倒在玻璃板上，易于铺匀。

2、层析板晾干时尽量保持水平，避免强风猛吹，否则制作的板厚薄不均。

3、活化时烘干以背面无水渍为准。

4、点样时要轻触疾起。

5、点样完毕将层析板放入层析缸时，要保持层析板下缘水平。

6、展层-显色剂液面应低于点样线，展层剂前沿大概跑到1/2处时取出

7、避免手触碰层析板和点样端边缘。

Ø实验现象：

●第一组：

1、制板后，约60min晾干。

2、点样时，第三个点点得较轻，其他点扩散后大小适中，不超2mm。

3、因层析缸不平整，浸入展层-显色液时层析板有些倾斜。

4、在层析约45min后溶剂前沿到达层析板的1/2处左右，取出并烘干。

溶剂前沿是一条凹陷明显的曲线。

5、在利用烤箱烘干后，层析板上出现5个倾斜的蓝紫色斑点，第一和第三个点相对模糊。

第一个点有拖尾现象，第三个点明显较其他点小，显色不明显。

6、板的周缘边出现有明显蓝紫色丝带。

如图：

●第二组：

1、制板后，约30min晾干。

2、点样时，点扩散后大小适中，不超2mm。

3、层展-显色剂前沿在前20min水平几乎无凹陷，之后开始出现细小凹陷。

至25min时前沿到达层析板的1/2处左右，取出并烘干。

溶剂前沿是一条有轻微凹陷的曲线。

4、在利用烤箱烘干后，层析板上出现5个明显的蓝紫色斑点。

第三个颜色较浅。

5、板的周缘边出现些许蓝紫色丝带。

如图：

Ø原始实验数据：

每个数据测量三次，取平均数。

●第一组：

表1第一组原始数据记录表

样品

色斑中心至样品原点中心距离（cm）

溶剂前缘至原点中心距离（cm）

测量1

测量2

测量3

平均数

测量1

测量2

测量3

平均数

精氨酸

1.21

1.19

1.20

1.20

4.50

4.50

4.50

4.50

丙氨酸

2.45

2.45

2.45

2.45

4.90

5.00

4.95

4.95

甘氨酸

2.45

2.51

2.48

2.48

5.00

5.08

5.04

5.04

混合1

1.20

1.16

1.18

1.18

5.14

5.16

5.15

5.15

混合2

2.50

2.51

2.51

2.51

5.14

5.16

5.15

5.15

说明：

1、由于薄层板点样端浸入展层-显色剂时，板与液面有倾斜，故选取经过点样起点和止点的连线作为样品原点中心距离，再延长和前沿线的交点作为前缘至原点中心距离，得出的实验数据，以减少实验误差。

2、溶液前缘到样品原点的距离是指对应的溶液前缘到样品原点的距离。

●第二组

表2第二组原始数据记录表

样品

色斑中心至样品原点中心距离（cm）

溶剂前缘至原点中心距离（cm）

测量1

测量2

测量3

平均数

测量1

测量2

测量3

平均数

精氨酸

0.97

0.98

0.99

0.98

3.96

4.00

3.98

3.98

丙氨酸

1.76

1.72

1.74

1.74

3.74

3.75

3.73

3.74

甘氨酸

1.35

1.32

1.29

1.32

3.79

3.85

3.82

3.82

混合1

0.98

0.98

0.99

0.98

4.05

4.11

4.08

4.08

混合2

1.99

1.97

1.99

1.98

4.05

4.11

4.08

4.08

【实验报告第三部分（结果与讨论）：

结果（定量实验包括计算）：

应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；

讨论：

不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。

结论：

简单扼要，说明本次实验所获得的结果。

（包括思考题）。

评分（满分45分）：

XX】

三、结果与讨论

Ø结果：

根据

计算。

●第一组：

样品

Rf值

推断

精氨酸

0.267

-

丙氨酸

0.495

-

甘氨酸

0.492

-

混合点1

0.229

精氨酸

混合点2

0.487

-

只能在误差允许范围内，认为混合氨基酸中含有精氨酸。

现有数据不能确定混合点2的氨基酸种类，本组实验认定为失败。

●第二组：

样品

Rf值

推断

精氨酸

0.246

-

丙氨酸

0.465

-

甘氨酸

0.346

-

混合点1

0.241

精氨酸

混合点2

0.485

丙氨酸

在误差允许的范围内，确定混合点1是精氨酸，混合点2是丙氨酸。

混合氨基酸由精氨酸与丙氨酸组成。

Ø讨论：

对比两组实验，可以发现，操作是否达到要求严重影响实验结果，甚至决定实验成败。

项目

第一组

第二组

分析

层析板晾干

空调猛吹，晾干时板不水平

自然晾干

根据溶剂前缘曲直程度可以看出第一组的板明显厚薄不均，较第二组差别很大。

晾干时间

约60min

约30min

欲速则不达，应严格按照实验要求操作。

边缘效应

十分明显，影响很大

大有改善，不明显

烘烤时间

长

短

层析板在层析缸中位置

倾斜

不倾斜

第一组倾斜，导致展层-显色剂展层方向与层析板方向有偏差，数据无法使用。

显色效果

模糊，颜色不明显

清晰，颜色明显

点样时第二次较第一次有经验，点样较成功。

综上讨论：

1、实验时一定要严格按照实验要求操作。

2、多做才能熟能生巧。

3、做实验时要有耐心，欲速则不达。

4、实验时要根据实际情况随机应变，不能墨守成规。

（第二组时，层展-显色剂前沿在前20min水平几乎无凹陷，之后开始出现细小凹陷。

此时前沿已接近层析板二分之一处，应及时取出，避免因厚薄不均引起更大的数据误差）

Ø结论：

●实验结论

　　实验条件严格达到要求的情况下，测得混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸两种氨基酸。

●思考题

1、硅胶的吸附力与含水量的问题。

答：

硅胶的活性可分为5个等级，活性等级越大，硅胶的吸附性能越小。

该活性与水的含量有关。

在一定的温度下，加热以除去水分可以提高活性和吸附，这就是所谓的活化。

然而，温度应在一定的限度，因为高温可以改变吸附剂的内部结构和不可逆地降低的吸附。

（硅胶活性级别与含水量关系：

Ⅰ:

0%;Ⅱ:

5%;Ⅲ:

15%;Ⅳ:

25%;Ⅴ:

38）即，吸附力越大，含水量越少。

2、吸附实验中吸附剂的选择根据。

1）吸附剂应该具有最大的表面积和吸附力。

2）吸附剂对不同的物质有不同的吸附作用。

3）吸附剂不能与溶剂和样品发生化学反应。

4）吸附剂应均匀，且不能在操作中被损坏。

3、氨基酸纸层析，两者有何区别。

1）吸附剂：

薄层层析使用硅胶,纸层析使用纸张。

2）分辨率：

薄层层析具有的分辨率比纸层析高。

3）速度：

薄层层析比纸层析更加的快。