BHK21法制人用狂犬疫苗.docx
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BHK21法制人用狂犬疫苗
摘要
狂犬疫苗是一个历史悠久的疫苗,是嗜神经性病毒引起的人兽共患的传染病。
法国科学家巴斯德于1885年发明。
我国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞,培养后,收获毒液,经浓缩、纯化、精制并面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。
狂犬疫苗的推广应用大大降低了人间狂犬病的发病率。
到目前为止,世界上还未有一种有效的治疗狂犬病的方法,发病后的死亡率几乎100%。
所以,凡被病兽或带毒动物咬伤或抓伤后,都应立即注射狂犬病疫苗。
精制地鼠肾细胞狂犬疫苗生产中,地鼠肾细胞在组织培养中的生长状况对狂犬病病毒的培养起着决定性作用,而细胞生长的质量和新生小牛血清对肾细胞的保护与促进生长作用有至关重要的关系。
关键词:
毒种疫苗制造细胞瓶牛血清
引言3
1.试剂与仪器3
1.1毒种制备所需3
1.2疫苗制备所需4
1.3培养瓶对细胞的影响4
1.4牛血清对细胞的影响4
2.毒种4
2.1毒种来源4
2.2毒种传代5
2.2.1毒种悬液制备5
2.2.3接种5
2.2.4取脑5
3.疫苗制备6
3.1操作人员的消毒准备6
3.2地鼠制备6
3.2.1地鼠皮毛消毒6
3.3种毒洗换7
3.3.1洗液7
3.4无菌实验8
3.5取毒力8
4.影响因素9
4.1培养瓶对地鼠肾细胞的影响9
4.1.2方法9
4.1.3细胞生长情况,一般在光镜下分成四级9
4.1.4浓缩9
4.1.5检定9
4.2牛血清对细胞的影响10
4.2.1地鼠肾细胞悬液和病毒液的制备10
4.2.2细胞生长情况的判定标准10
5.实验结果11
5.1疫苗制备11
5.2细胞瓶对肾细胞的影响11
5.2.1细胞生长情况比较11
5.3牛血清对肾细胞的影响13
6.结语及展望15
致谢16
参考文献17
引言
目前,养宠物的家庭越来越多,不少喜爱宠物的人都有被爱犬或爱猫等小动物多次咬伤的经历,因此,他们关心已接种过狂犬病疫苗又被狗等小动物咬伤后,是否还需要再接种狂犬病疫苗?
据统计,在我国95%以上的人狂犬病是由犬狂犬病传染所致。
狂犬病是凶险的疾病,人一旦感染上几乎百分之百死亡。
因此被犬致伤后要及时去医院处理伤口,并去当地卫生防疫站注射狂犬病疫苗。
预防狂犬病惟一有效的措施是接种狂犬病疫苗。
轻度被犬咬伤者需接种狂犬病疫苗5针(全程免疫);如在一年内再次被犬咬伤,还需加强注射狂犬病疫苗1针;如全程免疫一年后再次被犬咬伤应该加强注射2~3针。
咬伤严重或特殊情况下,则应由防疫站医生根据情况酌情处理。
狂犬病是由嗜神经性的狂犬病病毒引起的一种人畜共患烈性传染病,世界范围流行,其发病和死亡率居我国甲、乙类传染病之首。
目前狂犬病治疗全世界无特效药,一旦发病其死亡率为100%,及时进行狂犬病疫苗接种为预防、控制和消除狂犬病唯一有效的保护性措施,因而生产出安全高效的狂犬病疫苗尤为重要,而筛选出优良的生产用病毒株是制造疫苗的关键。
我国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞,培养后,收获毒液,经浓缩、纯化、精制并检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。
1.试剂与仪器
1.1毒种制备所需
2%灭活小件血清注射用水离心沉淀器一台乳钵,平皿玻璃沙吸管(1ml10ml),1ml注射器,中试管,镊子,弯剪,50ml沉淀离心瓶,乳胶手套分装豚鼠脑毒种用的250ml血浆瓶等装铝箱送高压125Pa,温度121灭菌备用
1.2疫苗制备所需
汉克氏液牛血清199培养液人血白蛋白7.5%NaHCO3甲醛柳硫汞胰酶15升瓶 5升瓶100毫升三角瓶三角虹吸装置,眼科剪刀若干,眼科镊子,外科钝头剪刀,橡胶塞,烧杯,三角烧瓶带玻璃珠纱布条鸡玚带,不锈钢漏勺,以上器材装铝箱送高压灭菌.另外还准备3瓶用棉赛包布包好扎好送高压125帕121度灭菌一小时备用,此外还准备地鼠板
1.3培养瓶对细胞的影响
.地鼠12~14日龄(卫生部长春生物制品研究所实验动物室提供)小白鼠昆明种体重11~13g(中国医科大学实验动物部提供)3.细胞培养瓶3L和10L(成都市万福玻璃仪器厂出品)转瓶机3L和10L转瓶机(均为辽宁省医疗器械研究所生产)狂犬病固定毒aG株(疫苗株)和CVS株(攻击株)(均为中国药品生物制品检定所提供)
1.4牛血清对细胞的影响
新生小牛血清(沈阳安迪生物高科技公司提供)浓度为8%;0.25%水解乳蛋HanKs生长液;0.4%人血蛋白HanKs-SML维持液;12~14d龄地鼠肾细胞,实验组和对照组解剖取肾,均经胰酶消化过夜,分散备用;狂犬病毒毒种(中国药品生物制品检定所提供),狂犬病固定毒“北京株”(aG株);小白鼠昆明种(购于中国医科大学实验动物室),体重11~13g。
2.毒种
2.1毒种来源
aG株,由中国药品生物检定所委托卫生部制品研究所分发,生产用毒种不超过aG5代。
2.2毒种传代
2.2.1毒种悬液制备
感染豚鼠(120g-180g)用的病毒悬液在无菌操作室内制备,已合格存放于—40度冰冻保存组织培养适应株脑毒种(aG株)取出后迅速放放流水中解冻,解冻以后取出入平皿内称重用稀释液洗去甘油,洗液不少于10ml玻璃少放放乳钵内,同时放入豚鼠脑毒种,研磨成均匀后吸入50ml沉淀离心瓶内以1000r/min离心10min,取上清液,再稀释后冰溶备用。
2.2.3接种
接种按无菌操作进行首先用1ml注射器吸取已稀释好的毒液1ml,然后左手大拇指和食指抓住豚双鼠耳部,用手掌把豚鼠固定在操作台上,右手用5%碘酊消毒颅中部及四周,消毒完毕,取已吸好毒种液的1ml注射器用4号针头于颅顶旁入脑,每只豚鼠接种毒种0.1ml接种后每天喂莴笋,混合干饲料,同时,观察豚鼠发病情况先具有典型狂犬病症状的豚鼠收剖。
2.2.4取脑
在无菌操作室内进行,用剪刀尖掀开颅顶骨用镊子将脑(包括大脑,中脑,小脑,脑桥,延脑)取出,放250血浆瓶内,取脑同时随机抽取一部分样品作病毒滴定用,每个血浆瓶内装有玻璃珠,每一个脑装入一个血浆瓶内,编上号码用10ml吸管加入灭菌生理盐水10ml洗脑作无菌试验,塞好瓶盖,盖好铝盖,放-20度冰箱保存备用。
3.疫苗制备
3.1操作人员的消毒准备
在万级区,换拖鞋洗手进一更,换白大褂戴帽,进入十万级区换拖鞋,用肥皂杀菌洗手三次以上,进入二更从上到下:
换帽,戴口罩,穿缓冲衣。
进入百万级区(进三更),穿无菌衣(四联体衣)再戴口罩,戴医用上手套。
进入无菌操作间后,用酒精棉球对手心和手背全面消毒。
注:
进入无菌间进行操作,操作人员都须进行以上无菌程序,才可以操作
3.2地鼠制备
3.2.1地鼠皮毛消毒
把12-14日地鼠放放搪瓷桶内加乙醚加盖使地鼠麻醉致死,5. 用自来水冲洗除去木屑饲料,6. 粪便,7. 用纯净水洗若干次用甲醛浸泡15分钟,8. 用甲醛与新洁尔灭混合液浸泡15分钟,9. 再用新洁尔灭泡10分钟。
3.2.2解剖取肾
按无菌操作在无菌室内将消毒后的地鼠固定在地鼠板上沿地鼠12根肋骨下,脊柱两侧剪开后,腹膜1厘米的纵切口,暴露出肾脏,此时如果发现腹腔充血渗出液等应废弃,并更换剪刀,再剪下一个,两手执镊子,一把固定肾脏并协助取肾,另一把穿肾,取肾顺序从右向左,取出的肾脏放无菌100毫升烧杯,用灭菌汉克氏液300毫升冲洗倒入另一只灭过菌的100毫升的烧杯内用16厘米外科顿头剪刀剪成肾组织块
3.2.3肾组织块的洗涤与消化
将剪碎的肾组织块放入带有玻璃珠的100毫升的三角烧瓶内,用汉克氏液洗三次,每次洗量800毫升除去脂肪,血液,尿液,洗后的肾组织块加入0.1%胰酶消化液,冷却消化18-24h。
肾细胞块皮质部分基本离散,呈现发白,实质部分呈现暗红色。
3.2.4分散细胞
3.2.4.1生长液配制
15升汉克氏液,肾组织块1000毫升三角烧瓶按顺序放在无菌操作台上,在火焰下向15升瓶内加小牛血清,生长液NaHCO3液,然后依次装上互通的15升瓶管道,用止血钳夹住,根据需要开放
3.2.4.2去胰酶消化液
先加压将15升瓶内的汉克氏液压入1000毫升的三角烧瓶内800毫升加液时慢慢注入避免冲力过猛,让洗液充分洗涤肾组织块,然后再让肾组织块沉淀,如此洗三次,然后把15升瓶剩余的洗液排空。
3.2.4.4分散细胞
消化好的肾组织块去胰酶消化液后,按顺时针振动玻璃珠,使肾组织块分散为单个肾细胞,一般振三遍,使肾组织块全部分散为单个肾细胞,并导入已知生长液的15升瓶中如有尚未被分散的仍可重复上述操作,直至分散完为止
3.2.4.5细胞接种
分散好的单个肾细胞于15升瓶中充分摇匀后,通过导管接种3升培养瓶
3.2.4.6细胞培育
放37度恒温室转瓶机上,横躺培养2-3天,细胞可长成单层,在此期间24小时,观察一次细胞,了解细胞生长情况及其生长趋势
接种前从毒种工序领取无菌试验合格的生产用的毒种,在水中迅速融化,用玻璃珠振摇脑组织使之为匀浆在无菌室内用汉克氏溶液稀释毒种在水中迅速融化,用玻璃珠振摇脑组织,使之为匀浆,在无菌室内用汉克氏溶液稀释毒种
3.3种毒洗换
3.3.1洗液
细胞瓶种毒后20-24小时,搬入缓冲间,操作者按常规洗手,消毒后穿好操作衣裤鞋,戴上口罩帽子进入操作室,取病毒维持液混均匀后装上15升瓶虹吸管
3.3.2洗换
操作者横持细胞瓶,烧瓶口在火焰封闭下去平皿,盖上大钟罩加入维持液完,在火焰下塞上塞子,扎好瓶口放转瓶机上继续培养,收毒
3.3.3收液
中毒后的细胞培养5-7天收取病毒液培育成熟的细胞,从转瓶机上取下后用力摇下细胞,送入操作室缓冲间,包布作无菌试验,每只培养基接种0.5毫升取样塞好胶塞灭活完毕存放在4度-8度冰库冷冻,待无菌试验合格,毒力合格后混合过滤
3.4无菌实验
收液后取培养基试管,吸取0.5ML放入试管内(无菌操作)盖好管塞,在34度培养基室观察.一般培养一周并每隔一天观察一次。
3.5取毒力
取无菌毒力瓶,用吸管吸取收取的毒液15-20ML(毒力瓶不要放到火焰旁以免影响毒力)包裹好后送入质检科,测毒力。
灭活完毕,做完无菌检验,取毒力样后,把收取的液体存放在2-8度冷库,待无菌检验合格,毒力合格,类毒素测定后,混合送入超滤纯化部进行过滤纯化,最后送入分包装部进行分包装,然后存放到4度冷库待售。
4.影响因素
4.1培养瓶对地鼠肾细胞的影响
原代地鼠肾细胞是生产狂犬病疫苗的基础。
多年来,培养地鼠肾细胞多采用10L培养瓶,近年来亦有采用3L瓶者,究竟哪种瓶效果更好,说法不一。
为此,对上述两种培养瓶进行狂犬病疫苗平行生产和分析比较。
4.1.2方法
按常规法解剖地鼠,取肾消化,制成细胞悬液。
每个3L瓶接种10对肾细胞悬液,每个10L瓶接种20对肾细胞悬液(两种瓶单位表面接种的细胞数相等),同时接种病毒,置37℃恒温室旋转培养。
3L瓶角速度为14r/h,10L瓶角速度为7r/h(3L瓶半径为10L瓶半径的1/2,两种瓶的旋转线速度相等)。
培养72h在光镜下观察细胞,然后浸泡6h洗换,加维持液(3L瓶加0.7L,10L瓶加1.4L),置37℃恒温室旋转培养,96h收获。
细胞镜检在以上者再加维持液(3L瓶加0.5L,10L瓶加1.0L),置33℃恒温室继续旋转培养72h,第2次收获〔1〕。
4.1.3细胞生长情况,一般在光镜下分成四级
4.1.4浓缩
将病毒滴度≥5.5LogLD50/1.0ml的同批1、2次收获液合并后,用30万相对分子质量滤板进行3倍浓缩。
4.1.5检定
病毒滴度及效力检定方法按文献〔1〕进行。
4.2牛血清对细胞的影响
精制地鼠肾细胞狂犬疫苗生产中,地鼠肾细胞在组织培养中的生长状况对狂犬病病毒的培养起着决定性作用,而细胞生长的质量和新生小牛血清对肾细胞的保护与促进生长作用有直接关系。
为了解新生小牛血清在制备细胞悬液中对肾细胞的保护作用、对实验组和对照组细胞生长的差异及病毒液的毒力,笔者做了大量的实验观察和比较。
4.2.1地鼠肾细胞悬液和病毒液的制备
按现行PHKCV生产工艺进行。
地鼠由沈阳药科大学实验动物室繁育,将地鼠肾剪碎后放入三角瓶中,用HanKs液洗净,经胰酶4℃消化过夜,弃掉胰酶消化液,加入悬细胞液,吹打成单个细胞,制成细胞悬液。
实验组在悬细胞液(0.25%水解乳蛋白HanKs液)中加入新生小牛血清至6L备用;对照组在悬细胞液中未加小牛血清,将细胞悬液分别接种于10L培养瓶中的培养液里至1500ml/瓶,37℃旋转培养48h后,接种病毒培养24h,弃去生长液,换入0.4%人血白蛋白HanKs-SML维持液,34℃培养96h,收获病毒液,并做毒力试验测定毒力,在此过程中逐瓶观察细胞生长情况,肉眼及镜下计数细胞。
4.2.2细胞生长情况的判定标准
肉眼及镜下观察细胞生长状况并进行比较,分4种标准进行判定:
①贴瓶均匀,瓶壁无颗粒状生长,无死细胞团状物浮于液体中,细胞呈梭状、透明、饱满、均匀密布瓶壁者为4个加号(+);②贴壁均匀,瓶壁无颗粒状生长,无死细胞团状物浮于液体中,细胞呈梭状、透明、饱满、均匀密布瓶壁达总面积3/4以上者为3个加号(+);③贴瓶不均匀,有颗粒状或岛状生长,细胞呈梭状,透明度差,有细胞团移动,密布瓶壁达总面积的2/4以上者为2个加号(+);④贴瓶极不均匀,有颗粒状或岛状生长,细胞呈梭状,透明度很差,有细胞团移动,密布瓶壁达总面积1/4以下者为1个加号(+)。
以2个加号()以上者为合格,以1个加号(+)以下为不合格。
5.实验结果
5.1疫苗制备
在培养过程中,3L瓶内的狂犬病毒细胞,在倒置显微镜观察:
起初单个细胞呈子弹状,在培养过程中,有单个的子弹状逐渐变成梭形、菱形,此时说明细胞发育、贴满瓶壁。
在观察过程中,若有其他,说明有杂菌生长,应当剔除保留无杂菌的。
5.2细胞瓶对肾细胞的影响
5.2.1细胞生长情况比较
本次试验镜检3L瓶细胞54瓶,以上的53瓶,占98.15%;镜检10L瓶细胞53瓶,以上的50瓶,占94.34%,二者差异无显著意义(χ2=1.94,P>0.05)。
表1 病毒收获液毒力
批号
收获次数
毒力(LogLD50/1.0ml)
3L瓶
10L瓶
9801
1
6.00
5.83
2
6.00
6.00
9802
1
6.83
6.13
2
7.00
6.50
9803
1
6.13
5.50
2
6.83
6.50
9804
1
6.00
6.13
2
6.67
6.83
9805
1
6.50
5.83
2
6.67
6.13
9806
1
6.67
6.00
2
7.00
6.50
应用两种细胞培养瓶各生产浓缩疫苗6批,经效力检定,结果3L瓶疫苗平均的效力单位与10L瓶疫苗差异无显著意义(t=1.87,P<0.05),见表2。
表2 浓缩疫苗效力单位比较
批号
效力(IU/2ml)
3L瓶10L瓶
9801
2.5
1.66
9802
2.79
2.64
9803
2.47
2.54
9804
1.53
1.30
9805
2.84
2.50
9806
2.64
2.64
细胞培养瓶瓶壁旋转的线速度相等,但3L瓶细胞在营养液外的旋转时间为2.7-3min之间,明显少于10L瓶细胞在营养液外的时间6.17~6.42min。
细胞在营养液外的时间越短,越有利于细胞生长,细胞生长情况越好,也越有利于病毒繁殖。
这可能是
3L瓶病毒滴度高的主要原因。
效力单位在一定程度上与疫苗液中积蓄的病毒量相关,此与收获时间有一定关系,有待进一步试验。
另外,还发现两种细胞瓶一次病毒收获液的毒力高低相对应,即高均高,低均低,说明除不同规格细胞瓶是影响因素外,还有其它因素。
5.3牛血清对肾细胞的影响
试验组与对照组细胞生长情况见表3
表3试验组与对照组细胞生长情况对比
组别
批次
细胞培养瓶数
合格数
不合格数
合格率(%)
试验组
01-08
320
305
15
95.3
对照组
01-08
400
282
118
70.5
由表3可以看出,对照组细胞生长合格率01~08批为70.5%,实验组01~08批生长合格率为95.3%,经统计学检验差异具有非常显著性(χ2=74.3,P<0.01),对实验组和对照组收获病毒液后的毒力进行对比,实验组优于对照组,经统计学检验差异有显著性(H=21.5,P<0.05)(表4)。
此外,在大量的实验观察中还发现,当细胞生长良好且稳定时,收获后病毒液的毒力各批次之间也相对稳定;当细胞生长稳定时,收获后病毒液的毒力各批次之间相对不稳定。
表4 实验组与对照组收获病毒液后的毒力对比
生产批次
收获次数
毒力(LogLD50/ml)
生产批次
收获次数
毒力(LogLD50/ml)
试验组
对照组
试验组
对照组
01
1
6.17
5.50
05
1
6.33
5.88
2
6.33
5.88
2
6.17
5.67
02
1
6.67
6.50
06
1
6.50
5.88
2
6.50
6.13
2
6.67
6.33
03
1
6.00
5.88
07
1
6.33
6.13
2
6.17
6.33
2
6.33
6.33
04
1
6.50
6.17
08
1
6.33
6.67
2
6.00
6.00
2
6.17
6.13
收获液病毒滴度比较应用两种培养瓶各生产疫苗6批,各收获病毒液12次,经检定病毒滴度均≥5.5LogLD50/1.0ml,其中3L瓶毒力≥6.0LogLD50/1.0ml的12次,占100%,10L瓶毒力≥6.0LogLD50/1.0ml的9次,占75%。
二者差异有显著意义(χ2=3.98,P<0.05),
由实验组和对照组的结果认为,在制备细胞悬液时,后者在悬细胞液中未加入新生小牛血清,在室温下未洗净残留的胰酶,加快了细胞消化速度,短时间内可将部分肾细胞分解消化,使细胞损伤变得更加脆弱;因操作方法不当,使细胞与细胞之间剧烈碰撞,致使没有保护的肾细胞破裂而死亡,成活的细胞数量减少,细胞贴于瓶壁上生长的较少或贴瓶不牢固,在换液时极易被冲掉,而且收获后病毒液的毒力也相对不稳定。
抗胰酶物质,抑制了胰酶的活力作用,使残留部分的胰酶丧失蛋白分解作用,不再继续分解消化细胞。
新生小牛血清在制备细胞悬液过程中,在肾细胞周围能形成一种屏蔽的保护作用,减缓了细胞与细胞之间的碰撞速度,从而达到保护肾细胞免遭破坏的作用,细胞存活数量增多。
当培养条件适宜时,则细胞贴瓶均匀,且透明饱满,密布瓶壁上生长,贴壁牢固,在换液时不易被冲掉,收获后病毒液的毒力也相对较稳定。
两组疫苗经浓缩与纯化后,疫苗中残余牛血清蛋白含量均<50ng/ml。
经过大量反复的实验观察,证明新生小牛血清在制备细胞悬液过程中,确实对肾细胞能产生较强的保护与促进生长作用。
6.结语及展望
地鼠肾细胞培养后,毒液毒力低、疫苗效价低、外源因子难于控制、副反应大(Linetal1983)。
非洲绿猴肾(Vero)细胞可广泛应用于病毒疫苗生产。
对病毒较为敏感的细胞是生理状态良好的细胞,因此,在Vero细胞培养过程中不仅要考虑细胞的高密度,还要考虑细胞的高活性。
我国现行用于生产原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗毒株3aG株,是由狂犬病兔脑固定毒北京aG株经地鼠肾细胞连续传代,再经豚鼠脑与地鼠肾细胞交替传代3次获得的毒株即3aG株,在地鼠肾细胞培养后,毒液毒力低、疫苗效价低、外源因子难于控制、副反应大(Linetal1983)。
世界卫生组织(WHO)推荐使用目前国际上最先进、安全和有效性更好、使用方便的Vero细胞狂犬病疫苗,国内开展了Vero细胞狂犬病疫苗的研究工作,良好的生产用毒株是制造优质疫苗的关键,因而我国采用传代方法使狂犬病毒3aG固定株在Vero细胞上连续多次适应传代,经过检测筛选出了产毒率高、免疫原性好的Vero细胞适应株3aG-V。
本文将筛选出的3aG-V毒株进行了生物学特性研究,以期为研究纯度高、效价高、稳定性好、无副反应的Vero细胞狂犬病疫苗提供依据。
致谢
此时此刻,看到自己一字一句写的论文终于脱稿了,我思绪万千。
回顾三年学习期间的一千余个日日夜夜,自己为有机会摆脱学习压力的烦恼与浮躁,静心钻研,潜心学习,并取得初步研究成果而感到欣慰。
欣慰之余,我要向关心和支持我学习、工作的所有领导、老师和朋友们表示真挚的谢意!
感谢他们对我的关心、关注和支持!
衷心的感谢在我收集资料、整理论文过程中给予援助和支持的胡晓兵老师,以及王振伟,王恺,陈西良等老师,论文的成果中也包含了他们的耐心指导与支持!
还有辅导员武琳琳老师,感谢她这三年对我的辛勤培育和帮助。
回顾三年,是你们的辛勤培育让我的人生之路更加宽阔和光明,生我者父母,育我者师也,老师之恩情我将终生难忘!
在即将毕业离校之际,我要感谢11级生物技术班全体同学的帮助和勉励,谢谢他(她)们三年来对我学习生活上的帮助,同窗之谊和手足之情,我将终生难忘!
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索。
我愿在未来的学习和工作过程中,以更加丰厚的成果来答谢曾经关心、帮助和支持过我的所有领导、老师、同学和朋友。
最后,衷心地说一句:
老师您辛苦了!
衷心的祝愿您工作顺利!
预祝各位老师新春愉快,马到成功!
参考文献
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(注:
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