胶体电泳分析DNA片段.docx
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胶体电泳分析DNA片段
膠體電泳分析DNA片段
國立中興大學植物病理系張碧芳助理教授
前言
核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性,於電場中會穿過膠體,如:
agarose或polyacrylamide膠體,而朝向正極移動。
因為不同分子量的核酸,在膠體孔徑中移動的速度會有差異,藉此將不同大小的核酸分開。
Agarose膠體為較普遍用為電泳的材料,主要因為其製備方便及簡單,常使用在200bp~50kb核酸片段間的分析,且通常以水平式電泳槽來進行電泳。
然而,polyacrylamide膠體的製備相較於agarose膠體則較為麻煩,且未聚合前之acrylamide具有神經毒性,可經由皮膚或黏膜吸收,在操作上更應小心。
Polyacrylamide膠體電泳可有效分析小分子量的核酸片段,甚至小至1bp,如:
核酸定序,一般以垂直式電泳槽來進行。
膠體電泳的解析力
膠體電泳可分析小至數個核苷酸,大至百萬個核苷酸的染色體DNA,但它也有一定範圍的解析力,並不是一片膠體就可分析各種大小的DNA片段,故要得到好的解析力,必須要探討膠體電泳的解析範圍。
常用於分析DNA的膠體電泳有兩種,一種是洋菜凝膠電泳(agarosegelelectrophoresis,簡稱AGE),另一種為聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE)。
這兩種凝膠,由於其濃度不同時,所形成之凝膠體的孔洞不同,故其解析範圍不同。
對直線形DNA的有效分析範圍,洋菜膠常用0.3%至2.0%之濃度,可分析於1~60kb(kilo-basepairs或kilo-base)DNA分子(見表一),而聚丙烯醯胺凝膠常用濃度為2.5%至20%,可分析1~1000base或base-pair(bp)長度之DNA(表二)。
(資料來源:
曾等,1987)
(資料來源:
曾等,1987)
洋菜凝膠的製備非常簡單,又沒有丙烯醯胺的毒性,故為最常用的膠體,但AGE只適合於分析較大片段的DNA,故在1kb左右或更小的DNA片段,就只好用較不易操作的PAGE。
有時為了增加1kb左右DNA的解析範圍,也有使用洋菜凝膠與聚丙烯醯胺凝膠混合膠體作電泳,但其操作更麻煩,而且會因凝聚情況不同而得到誤差的結果。
為了方便分析1kb以下的DNA片段,1980年代美國FMC公司製產一種洋菜凝膠,稱為NuSieveagarose,它可配製成1~9%之凝膠,以分析較小片段之DNA分子,其解析力極佳,依不同的凝膠濃度而有不同之解析範圍(見圖一及圖二),但所使用的電泳緩衝液種類也會影響凝膠之解析範圍(見圖一A、B及圖二A、B之比較)。
一般常用之電泳緩衝液有三種,其配方如表三,其中以TAE及TBE最常用。
選用TAE或TBE緩衝液,對大多數電泳結果,並不造成太大的差異,但某些樣品的分析,有時卻有極大的差異,
(資料來源:
曾等,1987)
(資料來源:
曾等,1987)
(資料來源:
曾等,1987)
前述用NuSieve膠體電泳,只是DNA泳動距離(或稱速度)之差異而已,對所得結果之判讀,還不會造成誤差。
不過,如果想把AGE分離之DNA片段回收再分析,則必須選用TAE進行電泳,否則對DNA回收率有影響,相反的,分析單股DNA時,卻常選用TBE。
電泳技術使用至為方便而可靠,但在分析DNA分子上,一直無法達到分析較大分子的染色體DNA,因此,多年以來,進行基因在染色體上定位的研究,完全依賴遺傳分析或配合顯微鏡的定位分析。
最近幾年,由於對電泳電場的試驗分析,已經開發可以用AGE作為分析大於100kbDNA分子。
以酵母菌染色體DNA所作分析結果,酵母菌內其中16條染色體之DNA大小在200kb至1500kb間,經由改變電場中電極於某一角度下交互轉換通電之結果,可以達到分離多數染色體DNA的目的,這些設計,包括一種稱為OFAGE(orthogonal-field-alternationgelelectrophoresis),其設計主要是電極以(90∘)直角交互對換通電。
另一種稱為FIGE(field-inversiongelelectrophoresis),為定期將電極作180∘轉換,其方式如向前電泳2秒鐘,向後電泳1秒鐘之交換進行。
而最好的設計,目前以CHEF(contourclampedhomogeneouselectricfields)電泳,可得到最好的解析力,其設計主要為一六角形之電泳槽之六邊上,圍繞上電極,以120∘角度交互作電泳。
上述這三類之電泳設計,即為一般所稱之脈衝電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis),而電泳中之脈衝交互通電之角度以120度之解析力似乎最好。
影響電泳的因素
核酸在電泳時,其移動速率與分子量大小成對數反比,而與核酸序列的組成鹼基無關。
其他影響電泳的因素有:
(一)膠體濃度:
濃度之高低,與膠體之孔徑大小有關。
濃度高,孔徑小,適合小分子量的核酸電泳;而濃度低,孔徑大,適合大分子量的核酸電泳。
一般agarose的濃度為0.3~2.0%,適合分析100~60,000bp大小之核酸;polyacrylamide之濃度則為3.5~20.0%,適合分析6~3,000bp大小之核酸。
(二)核酸結構:
不同形狀之同種DNA,在相同條件電泳,其移動速率會有所差異,如:
超螺旋DNA(supercoil)、缺口性環型DNA(nickedcircular)及直線型DNA(linear)等三種型態一同電泳時,超螺旋DNA移動速率最快,其次為直線型DNA,缺口性環型DNA速率最緩慢。
(三)電泳緩衝液之鹽類成分:
緩衝液之鹽離子濃度會影響核酸電泳結果,在高鹽離子濃度下,對電泳液pH值的緩衝能力佳,但因為在固定電壓下會使電流傳導增強,致產生過熱的情況,甚至其熱度可使膠體融熔;在低鹽離子濃度下,則電流傳導不易,致核酸不易移動。
電泳緩衝液依其所含鹽類不同,可分為三類(如表三):
Tris-acetate(TAE)、Tris-borate(TBE)和Tris-phospdate(TPE)。
TAE含40~50mMTris-acetate,當電泳時,acetate會被氧化成碳酸鹽,造成陽極pH值上升,陰極pH值下降,使得緩衝能力逐漸消失,所以長時間以TAE電泳,必須更換緩衝液。
TBE含89~90mMTris-borate,是目前常用的緩衝液,其緩衝能力良好,可經長時間電泳。
Agarose膠體電泳通常使用0.5×TBE;polyacrylamide膠體電泳則使用1×TPE。
TPE含50mMTris-phosphate,經長時間電泳,緩衝能力會降低,必須更換緩衝液,且其不適於利用酒精沉澱自膠體中回收核酸,因為磷酸鹽亦會被沉澱下來。
電泳結果的觀察
核酸電泳後,膠體中的核酸可經ethidiumbromide(EtBr)染色,EtBr會嵌入核酸鹼基中,以紫外線照射,則核酸吸收紫外線波長的光線,再經EtBr放出可見波長的光線,藉以觀察核酸之位置。
EtBr染色之濃度為0.5μg/ml。
除了在電泳後,再將膠體浸染於EtBr溶液外,亦可在製備膠體時,直接將EtBr加入膠體內,使核酸在電泳進行中被染色,以節省電泳後,需要染色的時間,但經EtBr嵌合的核酸,其電泳速率會降低,如:
直線型核酸,約降低15%的移動速率。
實驗流程
DNAGel之配法
1.0.5×TAEbuffer(緩衝液)之配法:
原液(50×)稀釋100倍,即取30ml50×的TAEbuffer加水到3000ml。
2.如:
1%Gel:
取0.5×TAEbuffer40ml+0.4gagarose(先加agarose再把buffer倒下,順便沖一下留在瓶壁上的agarose)。
第1、4、7組用0.8%gel(0.32g/40ml);第2、5、8組用1.2%gel(0.48g/40ml);第3、6、9組用1.5%gel(0.6g/40ml)。
3.放入微波爐中加熱到完全溶解(約40秒(25ml)至2分鐘(150ml),視情況而定)。
先用40秒煮一次,再以每次10~25秒依次煮至沸騰,至少要沸騰3~5秒才可以,但不可太久,否則體積會減少,因為溶液的水會蒸發掉。
由微波爐取出agarose溶液,應等待10~20秒後,再輕搖三角瓶以混合均勻,以防熱溶液突沸燙手。
4.待已溶之agarose降溫至60℃左右(以手握三角瓶底不燙手即可),即可倒入製膠模型中,若有氣泡,可以吸管尖挑開,之後架上齒梳,待其冷卻,凝膠後(即gel由透明變成白色半透明果凍狀即可),輕輕將齒梳向上拉開(注意要慢慢拉開,否則要加DNA樣品的孔洞會破掉喔!
),即可進行電泳分析。
註:
50×TAEbuffer之成分:
2MTris-acetate,0.05MEDTA,其配法如下:
秤取242gTrisbase,於500mlRO水中攪拌至溶解,再加57.1ml冰醋酸(glacialaceticacid)及100ml0.5MEDTA(已將pH調至8.0),最後以RO水補足至總體積1公升。
DNAagarosegel(洋菜膠體)電泳法
1.將已配好之agarose凝膠(gel)由製膠模取出,注意不使膠體滑落,以衛生紙將膠模左右及下方之多餘凝膠擦掉,將膠體連同膠模一起放入電泳槽中,緩緩加入300ml之0.5×TAE緩衝液,直到緩衝液蓋過gel上之孔洞(well)即可,注意gel的放置位子應將孔洞朝電極負極處(即靠近電源開關那邊)。
2.將DNA樣品(各8μl)加入1/5體積(2μl)的6×Gelloadingbuffer(內含0.25%bromophenolblue及30%甘油溶於水中),以微量吸管混勻,分別加入gel上之各孔洞中。
以12孔洞之50mlgel而言,每孔洞可加入(loading)最多30μl體積的DNA樣品(已加loadingbuffer後之體積)而不外溢,注意勿以微量吸管尖端刺破孔洞底部之gel,否則樣品會漏掉;另外要加入樣品時以微量吸管吸取混勻的DNA樣品,並避免吸入氣泡,若吸入氣泡,則在loading樣品時會使樣品溢出孔外而流失。
3.每片gel的最左及最右2孔分別加入DNA片段長度(basepair)標準液(100bpmarker)各10μl(原marker之4倍稀釋液),中間10孔分別加入待測之DNA樣品(總體積10μl),最後以50伏特進行電泳分析,約45分鐘後,可見藍色染劑已由原先洞口泳動至gel底部(電極正極處),此時可關電源,並將gel取出,進行EtBr染色。
4.註:
DNA因含磷酸根,故帶負電,在電場中會往正極移動。
Gel染色法
(本步驟較危險,由助教操作之)
註:
gel染色過程,必須全程戴手套,因EtBr為致癌劑,其會嵌入雙股DNA中,造成細胞突變,故染色後的gel也不可以隨意丟棄,請同學務必注意!
1.將電泳後之DNAgel放入100mlEtBr溶液(0.25μg/ml)中染色,並將染色盒置於震盪台上,使其染色較均勻,染色15~20分鐘。
2.將gel放入退染盒中(內含RO水)置於震盪台上退染10分鐘。
3.將gel移至UV燈台上,旁邊放置一把螢光尺,使刻度”0cm”處對準gel的孔洞處(螢光尺與gel距離約1cm),以「膠體照相系統」於暗箱內進行數位照相。
拍照完應馬上關UV燈,而且操作時一定要戴UV防護罩,以免眼睛及臉部皮膚受傷。
4.快門按下後,將影像存檔,即可直接以熱感紙印出電泳圖之影像。
5.由DNAmarker各條帶(band)之位置(如圖三),可推測各DNA樣品之大小(bp,basepair)。
另外,可將DNAmarker及樣品條帶在電泳中之移動距離量出,作為橫座標(單位cm),並以已知bp值作縱座標,在半對數表上作圖,可得DNA長度之log值和其在電泳中之移動距離呈線性反比關係(如圖二)。
1.5μl3μl
圖三實習中所用之Gen-100DNAladder(GeneMark,TechnologyCo.,Ltd.,Tainan,Taiwan)(2%0.5XTAEGel)
參考文獻
國立中興大學遺傳工程中心。
1999。
暑期基礎分子生物技術。
國立中興大學,台中,台灣。
國立屏東科技大學。
1998。
生物技術基礎實驗。
睿煜出版社,屏東,台灣,221頁。
曾義雄,陳信芬,陳慶三。
1987。
電泳分離技術研討會論文集。
行政院國家科學委員會,台北,台灣,98頁。
Sambrook,J.,E.F.Fritsch,andT.Maniatis.1989.MolecularCloning:
aLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.
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