造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的阻碍.docx
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造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的阻碍
造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的阻碍
张乃红,冯玫,鹿育晋朱镭,刘洁,高鸿鹏,李为民,乔振华
【摘要】本研究探讨造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞天然免疫黏附功能及红细胞对NK细胞杀伤活性的阻碍。
外周血枸橼酸钠抗凝,检测红细胞在自身血浆条件下对K562细胞的免疫黏附并计算黏附率。
用MTT法测定红细胞对正常NK细胞杀伤K562细胞活性的阻碍,并与未加红细胞时进行比较。
结果说明:
红细胞对K562细胞形成了"玫瑰花"样结合。
正常人红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为(±)%,造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为(±)%,与正常人相较较显著下降(t=,p﹤)。
不加红细胞条件下,正常人外周静脉血NK细胞杀伤K562细胞活性为67%-71%。
正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性杀伤率为(±)%,造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性,杀伤率为(±)%,二者比较有显著不同(t=,p﹤)。
结论:
造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附能力下降,正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性,而造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性,缘故需进一步研究。
【关键词】造血组织肿瘤
ErythrocyteNativeImmuneAdheringFunction(ENIAF)inPatientswithHematopoieticandLymphoidNeoplasmsandItsEffectonNKCellKillingActivity
AbstractTheobjectiveofthisstudywastoinvestigatethechangeofnativeimmuneadheringfunction(ENIAF)inselfplasmaofpatientswithhematologicandlymphoidneoplasmsanditseffectonthekillingactivityofNKcells.Thewholebloodwasanticoagulatedwithcitricacid.5μlprecipitatedredbloodcellsand500μlplasmaofpatientsorcontrolsweredirectlymixedwith750μlquantitativeK562cellsat37℃for30minutes.OneK562cellattachedbyoneormoreerythrocyteswascountedasonerosette,theratioofrosetteswascalculated.UsingK562cellsastargetcells,thekillingactivityofNKcellsisolatedfromnormolpersonswasdetectedbyMTTassay,thechangeofthekillingactivitywasobservedafteraddingRBCs.TheresultsindicatedthattheratioofrosettesformedbyRBCsof21normalcontrolsandK562cellswas%±%,andtheratioofrosetfesformedbyRBCsof24patientsandK562cellswas%±%.TheabilityofENIAFinpatientswithhematologicandlymphoidneoplasmswassignificantlylowerthanthatinhealthyindividuals(t=,p﹤).ThekillingrateofNKcellsinperipheralbloodofnormalindividuolswas67%-71%withoutaddingRBCs,anditincreasedby%±%afteraddingRBCsofnormalcontrolsbutdecreasedby%±%withRBCsofpatients.ItisconcludedthattheENIAFofRBCsinpatientswithhematopoieticandlymphoidneoplasmsdecreases,accompanyingthereductionofthekillingactivityofNKcellstoK562cells,sotodetectchangeofENIAFmaybehelpfulfortheassessmentoftheimmunologicalfunctionofpatientswithhematopoieticandlymphoidneoplasms.
Keywordshematopoieticneoplasm;lymphoidneoplasms;erythrocyte;innateimmuneadheringfunction;NKcell
红细胞作为天然免疫的一个重要的组成部份,是机体免疫平稳和稳固的重要基础[1]。
红细胞能够结合、固定、聚集免疫复合物或微生物,将其呈递给吞噬细胞[2,3],使吞噬细胞的吞噬作用增强4-6倍。
红细胞具有免疫调剂作用,能够增强T细胞依托的免疫应答,调剂B细胞的活化及Ig的产生,调剂补体的活化进程,还能增进NK细胞的杀伤作用。
研究说明,NK细胞直接介入操纵AML的复发;把NK细胞植入NOD/SCID小鼠排斥了植入的AML细胞,这也证明NK细胞对移植的AML有异体反映性。
红细胞的NK细胞增强因子(naturalkillercellenhancingfactor,NKEF)是抗氧化剂家族的重要成员,它存在于红细胞质内,能够显著增强NK细胞对K562杀伤活性。
造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的阻碍王海边等[4]成立了红细胞天然免疫黏附功能的快速检测方式。
该方式操作简单、重复性高和稳固性好。
咱们应用此方式研究了造血和淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的天然免疫黏附功能,用MTT法测定了造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对正常人来源的NK细胞杀伤K562细胞活性的阻碍。
材料和方式
病例来源
造血与淋巴组织肿瘤患者来源于山西省人民医院或山西医科大学第二附属医院血液科门诊及住院患者,正常对照者为门诊体检的健康人,年龄、性别组成一致,具有可比性。
患者24例,男性15例,女性9例,年龄19-57岁,其中CML3例,AML10例(M36例,M42例,M52例),MDS1例,ALL7例,MM2例,NHL1例。
正常对照21例,男性13例,女性8例,年龄18-48岁。
患者血标本搜集时刻为初诊或化疗3周以后,以幸免药物对检测结果的阻碍。
要紧仪器
CO2培育箱(HeraeusandLISHEN公司生产),培育瓶(50ml),超净工作台,自动双重纯水蒸馏器(苏州净化设备厂生产),高速离心机(centrifuge5810R型),水浴锅,可调微量加样器、微量滴头,一般、倒置显微镜(Olympas),骨髓图象分析仪(天津),细胞记数板,40孔酶标板,流式细胞仪(Conlter公司产品),酶标仪分光光度计(北京六一仪器产品)。
要紧试剂
1640培育基购自晶美公司,10%胎牛血清,戊二醛,姬姆萨染液。
淋巴细胞分离液(Ficoll液),磷酸缓冲液(PBS),MTT粉末、DMSO购自晶美公司。
K562细胞培育
K562细胞购自中国科学院细胞库(上海),放于1640培育液中、在37℃、5%CO2条件下培育。
于倒置显微镜下观看K562细胞生长情形。
依照细胞密度每36-48小时半量换液次。
红细胞天然免疫黏附功能检测
由肘静脉取全血2ml,枸橼酸钠抗凝,1500rpm离心5分钟。
取500μl病人血浆和5μl沉淀的红细胞,直接加到750μl新鲜配制的定量靶细胞K562细胞(浓度为105/ml)悬液中,混匀。
37℃,水浴30分钟。
加1ml固定缓冲液%戊二醛),轻轻混匀,5分钟后阅片。
阅片要求:
取混匀液150μl加50μl姬姆萨氏染液,悬浮涂片(玻片的2/3)。
取4个角和中心5区阅片,每区阅读20个靶细胞,结合上红细胞(1个以上)的靶细胞为1个结合单位,计数100个靶细胞,计算黏附率(每例标本重复2次,结果取平均值):
红细胞黏附率(%)=[黏附1个以上红细胞的靶细胞数/5区阅读的共100个靶细胞]×100%
按常规方式分离效应细胞(外周血单个核细胞PBMNC),流式细胞仪检测其CD3-(CD16CD56)+细胞即NK细胞的表达(由流式细胞仪直接给出PBMNC中NK细胞的百分率)。
杀伤活性测定(最正确细胞密度、效/靶比及反映时刻由预实验取得)
以对数生长期K562细胞为靶细胞,调整细胞密度为4×105/ml。
之外周血单个核细胞为效应细胞,用RPMI1640培育液调整细胞密度为4×106/ml,效/靶比为10∶1,同时设靶细胞孔、效应细胞孔和RPMI1640空白对照孔。
上述各孔均设3个复孔。
效应细胞、靶细胞、RPMI1640孔各为50微升/孔(反映孔),效应细胞孔、靶细胞对照孔各为50微升/孔,RPMI1640孔为100微升/孔加入40孔板;另设1孔加RPMI1640培育液150微升/孔为调零点。
充分混匀,37℃、5%CO2培育4小时。
每孔加入20μlMTT(5mg/ml),继续孵育4小时(以上都在超净操作台操作)。
弃上清,每孔加DMSO150μl,充分吹打、混匀,10分钟内用酶标仪检测570nm波长OD值,按下述公式计算杀伤率。
NK细胞杀伤率(%)=[1-(实验孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100%
红细胞对NK细胞杀伤活性的阻碍
红细胞的制备健康人、造血与淋巴组织肿瘤患者的EDTA抗凝新鲜全血(搜集6小时之内利用),经淋巴细胞分离液(Ficoll)分离取得红细胞,用生理盐水洗涤2次。
红细胞的浓度用RPMI1640培育液调整细胞密度为4×106/ml备用。
红∶效=1∶1。
红细胞与效应细胞一路放入靶细胞,加入后进行培育,即进行杀伤实验。
以下步骤同。
统计学处置
结果用SPSS软件进行统计后分析,行独立样本检测(independentsampleTTest)。
数据以均数±标准差(±SD)表示;p进展转变、疗效评估及预后判定的重要参考指标[7]。
对造血与淋巴组织肿瘤患者,咱们用红白血病细胞株K562细胞作为靶细胞,外周血枸橼酸钠抗凝,在自身血浆中研究患者的红细胞对K562细胞ENIAF的转变。
结果说明,红细胞在自身血浆条件下对K562细胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"样结合,患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为(±)%,与正常人的(±)%相较显著下降(t=,p﹤)。
其他肿瘤患者红细胞的黏附功能与正常人的相较也明显低下[8]。
ENIAF的转变与血沉、淋巴细胞绝对值的转变显著相关,与归并糖尿病、慢性肝炎也有关系[9]。
自身免疫性肝病患者红细胞免疫黏附活性显著低于正常人群(p﹤),而且与自身抗体的升高、病情严峻程度紧密相关[10]。
造血与淋巴组织肿瘤患者中ENIAF转变的缘故与意义,尚需要进一步研究。
NK细胞杀伤活性检测多用灵敏细胞株如K562细胞,方式有MTT比色法、LDH释放法、3HTdR参入法等。
崔晓明等[11]研究结果说明,K562细胞数在(1-4)×104/孔时线性关系较好,效、靶作用的时刻定为2小时,加MTT后再作用4小时,效、靶比选择5∶一、10∶1结果较理想。
王琦等[12]对MTT比色法进行了改良,同时证明MTT比色法与3HTdR掺入法有高度的相关性(r=,p现代红细胞免疫学.上海:
上海第二军医大学出版社.2002:
40
2CraigML,BankovichAJ,TaylorRP.Visualizationofthetransferreaction:
trackingimmunecomplexesfromerythrocytecomplementreceptor1tomacrophages.ClinImmunol,2002;105:
36-47
3HamentJM,VanDijkH,FleerA,etal.Pneumococcalimmuneadherencetohumanerythrocytes.EurJClinInvest,2003;33:
169-175
4王海边,张景萍,郭峰等.红细胞天然免疫粘附肿瘤细胞的现象及意义.中华微生物学和免疫学杂志,2001;21:
263-266
5王海边,曾珍,鞠连才等.评估SARS病情进展快速检测方式的成立及应用.中华微生物学和免疫学杂志,2003;23:
572-574
6王海边,姜平,曾珍,等。
红细胞天然免疫黏附功能检测在评估传染性非典型肺炎(SARS)病情进展中的应用.中华医学杂志,2004;84:
27-28
7王海边,刘立明,鞠连才等.SARS患者红细胞天然免疫黏附功能转变的探讨.中华微生物学和免疫学杂志,2004;24:
181-184
8王海边,刘西泰,郑晖等.SARS定点医院工作人员的细胞及红细胞天然免疫黏附功能的转变.第二军医大学学报,2004;25:
265-267
9曾珍,张晓峰,王海边等.红细胞天然免疫黏附功能对判定重症严峻急性呼吸综合征预后的价值.中华传染病杂志,2005;23:
53-54
10孙宝霞,赵新萍,王海边.自身免疫性肝病患者红细胞CR1活性的转变及意义.中国卫生查验杂志,2004;14:
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11崔晓明,谢海宝,林茂芳等.四甲基偶氮唑蓝法检测自然杀伤细胞活性.中华医学查验杂志,1995;18:
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12王琦,王波,白惠卿.改良的MTT比色法测定NK细胞杀伤活性.宁夏医学院学报,1999;21:
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13CaligiuriMA,VelordiA,ScheinbergDA,etal.Immunotherapeuticapproachesforhematologicmalignancies.Hematology(AmSocHematolEducProgram),2004:
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14MillerJS,SoignierY,Panoskaltsis-MortariA,etal.SuccessfuladoptivetransferandinvivoexpansionofhumanhaploidenticalNKcellsinpatientswithcancer.Blood,2005;105:
3051-3057
15刘希英,吕锐.肿瘤病人红细胞免疫功能与自然杀伤细胞活性的关系.青岛大学医学院学报,2003;39:
35-36。
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