质粒构建流程.docx
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质粒构建流程.docx
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质粒构建流程
质粒构建流程
质粒构建流程
一、引物设计
1)取得目的基因序列,可选用数据库NCBI
2)软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点。
3)选择载体。
根据转染细胞和实验室资源,选择合适载体。
如pcDNA3.1(+),
4)选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点。
5)使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6)根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7)引物设计完成,送公司合成。
二、目的片段获取
1.RNA提取
试剂盒:
Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型(裂解液RL4℃、漂洗液RW-20℃保存)
准备:
冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套
操作步骤:
1)将1000μl裂解液RL加入细胞中,混合5min。
2)加200μl氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min。
3)4℃,12000rpm离心10min。
4)最上层水相转移至新EP管中(体积约550μl)
5)加入1倍体积(550μl)70%乙醇,混匀
6)全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4℃,10000rpm离心45s
7)弃废液,重套收集管,加500μl去蛋白液RE,12000rpm离心45s
8)弃废液,重套收集管,加700μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s
9)弃废液,重套收集管,加500μl去漂洗液RW,12000rpm离心60s
10)弃废液,重套收集管,12000rpm空离2min
11)吸附柱放入新EP管,加50μlRNasefreewater于膜上,室温放置2min
12)4℃,12000rpm离心60s
13)点样:
5μlRNA+1μl10×buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,3min,可见3条亮带。
14)-20℃保存
2.RNA反转录
试剂盒:
TaKaRaprimescriptRTreagentkitwithgDNAeraser(-20℃保存)
准备:
冰盒,
取出解冻,
为酶不可取出,预冷离心管
操作步骤:
1)基因组DNA去除(10μl体系)
5×gDNAeraserbuffer2μl
gDNAeraser1μl
TotalRNA4μl(可根据RNA浓度调整)
RNasefreewater3μl
PCR仪中进行,程序:
42℃,2min→4℃
注:
RNA的量可根据浓度调整,混合液冰上配制,酶最后加入
2)反转录反应(20μl体系)
5×primerScriptbuffer24μl
primerScriptRTenzymemix
1μl
试剂盒:
Microelutecycle-purespinprotocol(OMEGAbio-tek)D6293-01
将PCR产物加入1.5mlEP管,加入5倍体积bufferCP,混匀。
转移至HiBindMicroElutionDNA柱(套收集管),室温离心10000g,1min。
弃废液,加700μlDNAwashbuffer(含乙醇)到柱子,室温离心10000g,1min。
弃废液,重复
弃废液,空管离心13000g,1min
柱子放入新EP管,加10-20μlElutionbuffer到膜上,室温孵育3-5min,离心10000g,1min
电泳检测
1)割胶回收(产物电泳结果含杂带)
将含目的条带的琼脂糖凝胶切下(切得尽量小),放入1.5mlEP管。
加等体积(1g=1ml)bindingbuffer(XP2),60℃金属浴7min左右至胶溶解(溶液为淡黄色),混匀2min
溶液加入离心柱,离心10000g,1min,废液倒回再离一次
弃废液,加300μlbindingbuffer(XP2),离心10000g,1min
弃废液,加700μlSPWwashingbuffer,离心10000g,1min
重复
空管离心13000g,2min,弃废液,柱子转移到新EP管
加入30-50μlelutionbuffer于膜上,室温孵育1min,离心13000g,1min
电泳检测
三、双酶切
Vector12μl
10×M/L/Kbuffer3μl
3dH2O13μl
酶A1μl
酶B1μl
30μl反应体系如下:
PCR纯化产物15μl
10×M/L/Kbuffer3μl
3dH2O10μl
酶A1μl
酶B1μl
反应条件:
takara酶30℃水浴1h→65℃金属浴10min终止反应
注:
buffer类别依使用的酶具体选择,见附表
四、连接
1)双酶切后,可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl
2)酶切产物液相纯化
3)
PCR产物6.3μl
pcDNA3.10.7μl
10×T4buffer2μl
T4ligase1μl
3dH2O10μl
20μl连接体系(皆可)
PCR产物5μl
pcDNA3.12μl
10×T4buffer2μl
T4ligase1μl
3dH2O10μl
PCR仪中进行:
22℃,30min→4℃冰箱过夜
注:
连接产物-20℃可长期保存
五、转化
准备:
碎冰,灭菌EP管、LB空液体培养基,带抗性培养板,超净工作台,移液枪,水浴锅加热42℃
1)将感受态细胞置于冰上,待其融化
2)超净工作台中,将连接产物10μl加入100μl感受态细胞,或质粒1-3μl加入100μl感受态细胞
3)轻混匀,冰浴30min
4)热击水浴42℃,45s,冰浴1min
5)加900μlLB空培养基,摇菌150rpm,37℃,1h
6)浓缩离心13000rpm,1min,上清液留约200μl重悬菌体,部分涂板(50-100μl)
7)完全吸收后,37℃倒置培养12-16h
六、菌落PCR
1)以rTaq酶50μl体系配制PCR反应液,每个PCR管分装15μl,体系如下:
3dH2O35.7μl
10×buffer5μl
MgCl23μl
dNTP4μl
rTaq0.3μl
R-primer1μl
F-primer1μl
2)灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下,再在新板划板(注意编号),每板挑10个菌。
新划的板37℃倒置培养12-16h。
3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,记录含目的条带的菌落号备用。
七、测序
1.摇菌
1)PCR检测有目的条带的菌落,挑选2-3个较好的以供摇菌
2)三角瓶中分装10mlLB抗性液体培养基
3)用10μl枪头挑起选择的菌落打到培养基中
4)37℃。
250rpm摇菌12-16h
2.送样
每瓶取1ml箘液,送华大基因测序
3.比对
将测序结果与基因序列进行比对,比对正确则构建成功,比对错误则重新构建。
(注:
数据库中基因序列可能有误,若出现少数突变,可换其他数据库比对试试)
八、菌种保存
菌种比对成功,则可保存菌种备用。
1)超净工作台中取1.5mlEP管,加200μl80%灭菌甘油。
2)再加入800μl箘液,轻混匀。
3)液氮冻存。
(一个基因冻2管即可)
九、质粒提取
菌种比对成功,冻存菌种后,箘液用于提取质粒。
试剂盒:
AXYGENaxyprepplasmidminiprepkit250-prep
操作步骤:
1)取3-5ml箘液,室温下离心10000g,1min
2)弃上清,加250μlsolution
/RNaseA重悬菌落,混匀
3)加250μlsolution
,倒置轻混匀,孵育2min。
(整个裂解反应不超过5min)
4)加入250μlsolution
,立即倒置混匀,直到生成白色絮状沉淀。
5)室温离心13000g,10min
6)上清液小心转入HiBindminiprepcolumn(有套管),室温离心10000g,1min
7)弃废液,加500μlbufferHB,室温离心10000g,1min
8)选择性步骤:
重复第7步
9)弃废液,空管室温离心13000g,2min
10)柱子转入新EP管,加30-50μlelutionbuffer或3dH2O到膜上,室温孵育1-2min
11)室温离心13000g,1min
12)提取的质粒-20℃保存备用
附:
感受态制备方法(皆采用LB空白培养基):
1.菌种活化
1)用接种环直接取冻存的E.coli/DH5α菌种,在LB平板上划线,37℃倒置培养16h
2)挑单菌落转到2-10mlLB液体培养基中,摇菌37℃,250rpm,12-16h
3)取1ml箘液加入到100mlLB液体培养基,摇菌37℃,250rpm,3h
4)检测箘液OD600≤0.5(0.3-0.4)
2.感受态制备
准备:
0.1MCaCl2灭菌,50ml离心管灭菌,冰水,1.5ml离心管冰上预冷,离心机4℃预冷。
步骤:
1)将箘液用50ml离心管分装,调平,4℃离心3000rpm,8min
2)弃上清,0.1MCaCl210ml重悬(冰水中进行,动作轻),两管合成一管
3)冰上放置一段时间,4℃离心2500rpm,8min
4)弃上清,0.1MCaCl210ml重悬,4℃冰箱过夜沉淀
5)上清液取出8ml,剩2ml,加670μl80%甘油(箘液:
80%甘油=3:
1),轻混匀
6)1.5mlEP管分装,每管分装100μl,液氮冻存。
试剂配制:
1.琼脂糖凝胶(1.2%)
琼脂糖粉0.6g
1×TAE50ml
微波炉加热溶解,冷却一会儿后加入1μlgoldview核酸染料,混匀,倒板
2.电泳缓冲液TAE(50×)
2mol/Ltris-碱242g
1mol/L冰醋酸57.1ml
EDTA(pH8.0)18.622g
二蒸水至1L
用NaOH调节pH至8.6,常温储存。
用时稀释成1×溶液使用。
3.LB培养基
Yeastextract(酵母提取物)1g
Tryptone2g
NaCl2g
Agarpowder(琼脂粉)3g(配1.5%固体培养基时加入)
二蒸水200ml
灭菌20min,冷却后加入抗生素。
4.CaCl2(0.1M)
CaCl21.47g
H2O100ml
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