合肥工业大学级微生物论文文献翻译.docx

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合肥工业大学级微生物论文文献翻译

超高压和溶解二氧化碳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同灭活作用

王莉a,b潘见a谢慧明a杨一a林春明a

a微生物研究工程，中国教育部，中国安徽省合肥市屯溪路193号邮编2300009

b中国安徽省合肥市屯溪路193号邮编2300009合肥工业大学化工学院

文摘：

该研究主要是针对超高压和溶解的二氧化碳对微生物的协同作用。

该研究的目的是为了减少传统超高压技术的压力以便于使得更加经济可行。

超高压和溶解二氧化碳处理在液体中悬浮的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，与仅仅超高压处理在液体中悬浮的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，前者具有更强的杀菌作用。

为了加强二氧化碳的影响，一种新的设备被设计出来了，该设备能够溶解，保留和测量二氧化碳的浓度。

其结果显示出在300Mpa，1.2NL/L二氧化碳和250Mpa和3.2NL/L二氧化碳处理大肠杆菌能够使大肠杆菌降低8个对数级。

然而在仅300Mpa和250Mpa处理大肠杆菌时仅降低2.2和1.8个对数级。

对金黄色葡萄球菌来说，在350Mpa，3.8NL/L二氧化碳协同处理金黄色葡萄球菌将菌落数降低7个对数级以上，然而金黄色葡萄球菌将菌落数降低0.9个对数级仅在350Mpa处理金黄色葡萄球菌时。

标准电子显微镜照片表明了细菌的形貌的严重的变化在超高压和溶解的二氧化碳对微生物的协同处理以后。

相反，细胞仅在超高压处理时还是相对圆滑的。

在经过超高压处理后的细菌碘化丙碇荧光染色被观察来确定渗透性的变化。

其结果表示超高压和溶解的二氧化碳也促进了细胞膜渗透性的变化。

这可以推断出二氧化碳在细菌细胞膜上富集和在超高压下渗透性的变化解释了细胞膜的损坏和细胞的死亡。

关键字：

协同灭活二氧化碳的溶解超高压大肠杆菌金黄色球菌

1介绍

超高压灭菌（HHP）能够替代巴氏加热灭菌，在液相和固相食品体系中来保存营养是最有前景的非加热的灭菌工艺。

为了提高超高压的效率，减少操作压力和保压时间是很有必要的，这能够减少工艺过程费用。

除了处理的压力，细菌的耐压性也是一个重要的参数，这主要取决于细菌的种类和处理条件。

通常来说，要求超高压压力超过600Mpa或者更高的压力来达到灭活效率这已经限制了在超高压技术方面商业上的突破。

最近，为了减少灭活的压力，不同的协同有效条件得到了更多的关注，和一些共同条件已经被研究来优化工艺过程和超高压灭活机理。

这些联合的因数包括抗菌素，PH和合适的温度。

抗菌素来自于大自然，例如尼生素，片球菌素，溶解酵素和乳过氧化物酶已经和超高压协同处理细菌来查看灭菌效果。

这已经发现如溶解酵素和抗菌剂能够有效灭活的革兰氏阳性的细菌。

由于来自外层细胞膜的保护和多肽类和酶的抵抗，抗生素对革兰氏阴性的细菌更加不明显，尽管超高压在一定程度能够提高其敏感程度。

乳过氧化物酶和超高压400Mpa一起处理大肠杆菌并不能提高灭活效果。

在PH和适宜的温度协同超高压处理细菌，表明了非常有效的灭菌效果。

这些不同的因素能够对耐压和对压力敏感的食品细菌的灭菌效果。

二氧化碳是另一种抑制细菌生长的化合物。

和所提到细菌素和尼生素，小分子非极性的二氧化碳在超高压下能够渗透革兰氏阳性和革兰氏阴性的细菌，这会导致细菌细胞膜的有效破坏。

二氧化碳和超高压协同处理不同种类的细菌包括芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌的灭活机理已经被阐明。

在二氧化碳相区，超临界或接近临界二氧化碳被用来灭菌，这个过程和超高压一起处理细菌在二氧化碳中。

在DPCH技术中，二氧化碳气体压力一般在10到25Mpa和在30到50℃之间和保压1h以上来灭菌。

超高压能够被认为是比二氧化碳气体压力处理更安全和更经济的。

然而，这一挑战仍然存在在给定的二氧化碳浓度和可行的包装的超高压处理。

因此，协同灭活效果已经被限制在低二氧化碳浓度和超高压处理。

在当前工作，我们发展了一种先的方法去溶解二氧化碳和维持二氧化碳在溶液介质中。

在超高压和不同浓度的溶解二氧化碳处理细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）在更强的灭活效果已经被阐明。

这细菌在超高压协同二氧化碳和仅超高压处理后的细胞形态的变化和膜渗透的变化已经在标准电子显微镜下观察，和用碘化丙碇染色来册荧光来确定细胞膜前后渗透性的变化。

这结果能够能够提供有效的灭活效果在温和的超高压压力和更好的超高压和溶解二氧化碳的协同灭活效果！

2材料和方法

2.1微生物和生长条件

2种微生物（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）细菌被用来检测机理。

它们被接种在PH接近6.7的营养肉汤中或者接种在没有在37℃搅拌16h直到达到固定相。

细胞浓度一般108-109cfu/ml

2.2二氧化碳溶解度和超高压处理

二氧化碳溶解度和超高压处理已经被显示在图一。

为了溶解二氧化碳使其在特定的浓度和维持二氧化碳在营养肉汤在的渗透性，我们发明并且发明了耐压瓶其容量在100ml，其外径为35mm和0.35mm的不锈钢壁。

细菌悬浮液被转移到耐压瓶中为了充二氧化碳。

耐压瓶充二氧化碳通过钢瓶在1.5Mpa和4℃在10min到30min之间。

然后钢瓶在超高压的环境中。

耐压瓶被转移到高压中，细胞严重变形当在超高压釜中。

在刚瓶允许的内外压能够被精确计量为了保证在压力下能够使二氧化碳溶解和使细胞变形在超高压下！

压力等级在1升的高压容器中，其容器内径为75mm，240mm的高度和高压泵。

这容器加热和冷却主要是通过容器壁。

压力是通过液体作为传递介质的。

在实验开始时，细菌样本和压力介质要预先加热到实验温度通过热水温度。

在加压过程中，容器器壁的温度在20℃到30℃之间。

加压时间和泄压时间在10s之内。

这样本在钢瓶中将经历温度升高12℃和升压400Mpa然后温度下降。

绝热加热的影响在加压处理中是热传导。

因为热量将会消散，其最后的温度将降低4-6℃，这温度是指的的是初始温度。

作为对比，样品在没有二氧化碳处理是无菌的在30ml的无菌瓶中在相同的条件下。

表1二氧化碳的溶解在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的在无超高压处理的灭菌的影响

2.3二氧化碳浓度的测量

我们的目的之一是在不同二氧化碳浓度和超高压的协同作用的杀菌作用。

因此，测量准确测取二氧化碳浓度是很重要的，以便于确定实验条件。

二氧化碳在钢瓶中的释放出的二氧化碳导入150ml的0.5M氢氧化钠溶液中通过吸收和中和反应来确定二氧化碳的浓度。

吸收二氧化碳后的溶液，溶液中主要是碳酸氢钠因为氢氧化钠是过量的，过量的氢氧化钠是通过0.5M的氯化氢来中和的。

滴定的终点PH分别为8.32和3.89.样品中二氧化碳浓度计算和释放是标准的（NL/L），二氧化碳的在标准20℃状态下的压力是1atm。

Fig.2金黄色葡萄球菌（A和C）和大肠杆菌（B和D）在压力处理和不同二氧化碳浓度在30℃（A和B）和20℃（C和D）10min

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

压力

压力

2.4生存能力

细胞悬浮液连续的被稀释，并且1ml的稀释液被导入含有琼脂的培养皿中。

培养皿在37℃培养24h，菌落数就可以被计量。

微生物的生存率的表达是通过log（N/N0）来表达。

Fig.3二氧化碳浓度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活作用在350Mpa和250Mpa在30℃下10min

2.5固定和标准电子显微镜的观察

所有处理和未处理的细胞悬浮液在3500转下离心10min然后再悬浮在PBS缓冲盐溶液中。

悬浮液被弃掉来固定离心后的细胞膜，细胞膜立即被预定用0.1%戊二醛100mM，PH7.4，，1h然后用0.5%的戊二醛2h。

离心管用10mM的PBS淋洗。

这样品然后用浓度递增的30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%乙醇脱水2次。

这样，细胞将被冻干，在标准电子显微镜下观察。

2.6细胞染色和荧光观察

细胞膜渗透性的变化用碘化丙碇染色，样品将被离心和离心后在PBS中悬浮。

图A1.5mM的碘化丙碇在PBS中增加到浓度75mM。

然后通过碘化丙碇细胞悬浮液用流式细胞仪下观察。

黑白图像表明了总的细胞量。

荧光的强度代表了膜渗透的变化。

每次测量，至少300个细胞被计量。

未处理的处理

250Mpa和二氧化碳350Mpa和二氧化碳

250Mpa无二氧化碳350Mpa无二氧化碳

Fig.4标准电子显微镜下观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

（A）（B）（C）是大肠杆菌细胞。

（A）是未处理的（B）是3.2NL/L二氧化碳和250Mpa和（C）250Mpa图（D）（E）（F）是金黄色葡萄球菌。

（D）是未处理的（E）在3.8NL/L二氧化碳和350Mpa和（F）是仅在350Mpa下。

所有的HHP超高压处理下30℃下10min。

3结果

3.1二氧化碳的作用和大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生存能力

为了确定溶解二氧化碳对两种细菌的生存能力的影响，细菌悬浮在没有超高压处理的二氧化碳溶液中（条件是温度30℃）。

结果显示在表一中。

在前4h，金黄色葡萄球菌含量保持不变和大肠杆菌增加一点。

8h后对这两种细菌的的含量都有所减少。

溶解的二氧化碳在这些浓度下表现出了杀菌作用但是在最适宜的温度下24h内的没有体现杀菌因素的影响。

3.2超高压和二氧化碳的协同作用对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌作用

金黄色葡萄球菌浮液液在不同二氧化碳浓度下和没有二氧化碳和250Mpa到

440Mpa下处理10min。

结果显示在图2A中。

没有二氧化碳处理的样品显示出了高的灭菌效果在前期的报告中。

在30℃下440Mpa金黄色葡萄球菌处理后，灭活效果仅仅为1.7个对数级。

在30℃下2.6,2.8,5.5NL/L三种不同二氧化碳的浓度下和超高压一起处理细菌。

由于细菌悬浮在溶解的二氧化碳的介质中，协同作用非常明显,在30℃时350Mpa下灭活效果达7个对数级。

与在仅在350Mpa下处理灭活效果只能达到0.9个对数级，二氧化碳的协同作用使灭活效果达6个对数级。

大肠杆菌悬浮液在100到440Mpa下超高压处理，在有和没有二氧化碳下处理。

在图2B中所示，协同作用明显体现在150Mpa下，在300Mpa和1.2NL/L和250Mpa和3.2或4.5NL/L二氧化碳条件下灭活效果达8个对数级。

结果显示出大肠杆菌比金黄色葡萄球菌对压力更敏感。

由于压力在250到300Mpa下变化，协同作用仍然能够造成6个对数级的下降当与仅仅压力处理时。

由于一个相似的灭活等级，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在250Mpa比报告中的600Mpa和500Mpa小，仅仅在超高压处理细菌时。

对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌协同作用的灭活效果下降的很明显在20℃时，显示在Fig.2C和D中。

我们选出2种最高二氧化碳浓度的前2组实验中观察温度的影响。

对金黄色葡萄球菌来说，相同的二氧化碳浓度在5.5NL/L和350Mpa下，在30℃时灭活效果达7.8个对数级，而在20℃时只有3.5个对数级（Fig.2C）。

对大肠杆菌，在相同的二氧化碳浓度4.5NL/L和250Mpa下，在30℃仅有8.2个对数级，而在20℃时仅有3.9个对数级（Fig.2D）。

当温度从30℃减少到20℃时，大肠杆菌的压力得从250Mpa上升到350Mpa。

3.3二氧化碳的浓度对协同作用的影响

在30℃时金黄色葡萄球菌和大肠杆菌仅在超高压350和250MPa下处理灭活效果不明显，这造成0.9和1.8的对数级的下降。

灭活等级的迅速增加随着二氧化碳浓度的上升，对金黄色葡萄球菌在二氧化碳浓度在5.5NL/L和大肠杆菌在二氧化碳浓度3.2NL/L达到最大的灭活效果在Fig.3。

对金黄色葡萄球菌来说，要达到高的协同效果，需要稍高的二氧化碳的浓度。

换句话说，金黄色葡萄球菌比大肠杆菌在协同处理和仅超高压处理有抵制力更大。

3.4仅超高压处理和协同处理对细胞形态的变化

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的标准电子显微镜图在显示在Fig.4中。

未处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显示出圆滑的细胞（Fig.4A和D）。

在经过仅超高压处理和超高压和二氧化碳协同处理细胞形态发生明显的变化。

大肠杆菌在250Mpa下和二氧化碳处理后显示出细胞严重的变形和粗糙的表面和很多凹的表面和破裂的细胞，然而仅在压力250Mpa下细胞形态仍旧光滑和连续（Fig.4C）。

表2显示出在超高压和二氧化碳一起处理细菌能够引起近100%细胞形态的变化。

标准电子显微镜仍旧显示出金黄色葡萄球菌在350Mpa下主要维持他们的形貌除了一些凹陷（Fig.4F）。

然而，在二氧化碳处理下在相同的压力下，严重的内陷和收缩在细胞中发生，表明了细胞膜的变化和破坏（Fig.4E）。

没有细胞被破坏在SEM实验中，这是在前期试验报告中所不同的。

3.5细胞膜完整

Fig.5表明了细胞膜渗透性的变化通过不同的处理。

未处理的样品被表明了没有没PI染色。

在仅超高压处理的细菌只有一小部分的细菌被PI染色，这表明了绝大部分细菌任然保持了细菌细胞的完整性。

在溶解二氧化碳和超高压处理的细胞膜渗透性的变化从0.12变化到0.87和0.05变化到0.69对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在二氧化碳宁都在3.2NL/L和3.8NL/L条件下。

然而，渗透性的变化不能达到完整的的渗透性的变化，然而在温度处理条件下，灭活可以达到完整的程度。

细胞渗透的变化

4讨论

金黄色葡萄球菌，球形，革兰氏阳性兼厌氧性细菌，是以一种最耐高压的细菌。

据报道，金黄色葡萄球菌，在超高压400Mpa下造成大约1个对数级的灭菌效果，在仅在600Mpa下灭菌效果非常明显。

当超高压与低浓度的二氧化碳在5-6%在溶液中，灭活效果可以降低到500Mpa。

在研究中，我们观察到，灭活等级超过7个对数级对金黄色葡萄球菌来说在350Mpa下。

然而，随着二氧化碳浓度的增加，不需要更大的压力来发现明显的灭活效果。

大肠杆菌被选作研究的细菌之一是因为在食品中很常见，大量存在的革兰氏阴性细菌并且对各种抗生素不敏感。

在我们实验中，大肠杆菌表现出了和金黄色葡萄球菌在超高压和低的二氧化碳浓度下相似的敏感性。

这2种菌种的这些表现在前期的报告中，表现出了一定的区别。

对大肠杆菌来说，在250Mpa下二氧化碳的浓度处理后，灭活将达到6.4个对数级，这表明了不同于抗菌素的灭活模式。

我们将这归纳为二氧化碳渗透细胞膜在超高压的条件下。

另外，处理温度对协同灭活具有很重要的意义。

一种与温度相似的影响因素出现在二氧化碳的浓度中。

高的温度能够提高二氧化碳的扩散和能够增加细胞膜的流动性来使得渗透性变得更容易。

SEM图用来显示细菌细胞形态的变化，在经过不同条件处理后。

在我们的实验中，超高压在350Mpa和250Mpa下我们发现一半的杀菌效果对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

很大一部分能够存活在这些压力下，包含了一半的杀菌效果在适宜的环境中。

因此，SEM细菌细胞形态的在（Fig.4C和F）细胞仅在超高压处理后显示出了更小的变化和协同处理相比。

在溶解二氧化碳协同处理后，没有细菌存活和更严重的细胞形态的变化（Fig.4B和E）。

尽管在SEM图中不能与细菌灭活程度相符合，但能够显示出不同处理过程的意义，这能够显示出细菌受损的程度。

在二氧化碳和超高压一起处理细菌时，结果仍旧显示出了细胞破裂的更容易对革式阴性大肠杆菌来说与革式阳性的细菌。

在溶液中二氧化碳浓度在很大程度上取决于温度、压力的接触时间和气体和液体界面面积。

众所周知,二氧化碳溶于水相,形成碳酸,从而进一步电离出H+离子,从而降低溶液的pH值。

研究表明，降低pH值可能会改变酶构象和膜透性的影响,这将增加细菌对高压力的敏感性。

讨论pH值在实验中的影响,化学　　方程和标准平衡常数（命名为KΘ25°C），二氧化碳溶解反应可以列出如下:

CO2（aq）+H20（l）H2CO3（aq），Khθ=1.7*10-3

H2CO3（aq）H+（aq）+HCO3-（aq），Ka1θ=2.5*10-4

HCO3-（aq）H+（aq）+CO32-（aq），Ka2θ=5.61*10-11

从理论上讲,基本的化学平衡方程如下:

LnKa=ΔGθ/RT

在反应中Ka是反应的平衡常数,ΔGΘ是吗标准自由能量的变化。

使Ka对压力的偏导数，可以得到方程如下:

相比其它作为酸化剂有机酸相比,二氧化碳灭活效应已经得到一些作者的阐明。

它被广泛地接受,这主要是二氧化碳在细胞渗透。

　具体细菌细胞溶液在酸性环境中重悬浮将有助于微生物失活,这可以归结为以下两个方面。

（1）二氧化碳富集于细菌细胞表面。

一般来说,因为碳酸的平衡反应常数很小（1.70×10−3）,大多数的溶解的二氧化碳以分子形式存在，应该考虑为细菌失活的原因。

此外,还存在一个集中的重新分配　　二氧化碳在细胞悬浮液中。

营养肉汤在我们的实验中,是均相溶液，在这溶液中细菌细胞悬浮并且形成多相体系。

二氧化碳分子扩散向细胞表面和富集在那里由于有利的热力学因素。

因此,二氧化碳在细菌表面的浓度比在液相主体中的浓度高的多。

大的比表面积细菌的细胞也有利于浓缩。

CO2在细胞表面的聚合解释如下：

二氧化碳的富集会减少细胞膜的水溶性且易于改变离子渗透性，细胞及其外部环境细胞之间的界面张力被发现是非常低的,通常不到1dyne每厘米。

这样可以促进新陈代谢的密切接触交流。

周围的二氧化碳分子会屏蔽这些交往和细胞引起细胞麻醉昏迷,这一般可逆。

（2）细菌细胞膜混乱由于在高压下CO2的渗透和扩散。

然而，在高压下并不是同一种情况，在高压下会促进小且亲脂性的CO2容易渗透进细菌细胞。

CO2在分子聚集在细胞表面且形成碳酸，降低细胞内的PH。

压力促进CO2分子的渗透。

当压力被卸下来时CO2能够从细胞内扩散出来，且破坏细胞膜，这就导致了细胞的变形，在Fig.4B和E中。

在高压下能够使细菌细胞膜混乱，在高压协同CO2处理细菌时，有所提高细胞膜的混乱程度，因而杀菌效果得到提高。

5讨论

总之，该结果表明HHP和CO2协同处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌灭菌效果非常明显。

一个原始的方案使得能够成功表明该灭活因素即在悬浮介质中溶解和维持CO2浓度。

2个菌种经HHP和CO2协同处理在SEM图中可知细胞变形很严重。

细胞膜渗透性可以由PI染色测荧光来表征。

结果表明细胞死亡和膜受损与CO2在细胞表面富集和在压力下向细胞内扩散。

CO2便宜且对食物安全且容易移除，能够很大程度上降低压力。

更多的研究将要被采取为了去研究对细菌灭活的协同因素。

特别是更多的抗药的,如孢子。

目的是为了验证新的工艺和使得超高压技术更经济可行。