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完整版几丁质对海洋生防酵母抑菌活性的影响及相关机理的研究毕业设计
工学学士毕业论文
几丁质对海洋生防酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究
AThesisfortheDegreeofB.Eng
ImpactandMechanismofChitinontheMarineYeast’sAntibacterialActivity
Candidate:
LaifengLu
Supervisor:
GuangfengKan
AcademicDegreeAppliedfor:
BachelorofEngineering
Specialty:
FoodScienceandEngineering
DateofOralExamination:
June,2010
University:
:
HarbinInstituteofTechnology
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日期:
年月日
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日期:
年月日
导师签名:
日期:
年月日
摘要
生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质,通过喷洒或浸渍果实处理,以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。
本实验通过利用酵母细胞壁组分之一几丁质诱导培养本实验室分离得到的拮抗菌株海洋酵母RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman(经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心CABIBioscienceIdentificationServices鉴定为RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman)以提高其采后果实病害生物防治效果。
结果如下:
(1)体内试验结果表明,几丁质诱导后,R.paludigenum的果实采后青霉病害生物防治效果得到显著提高。
(2)几丁质诱导提高R.paludigenum生防效力的最佳诱导浓度为1.0%(wv),最佳诱导培养时间为36~48(oneoftheyeastcellwallcomponents)toco-culturewithRhodosporidiumpaludigenumFell&TallmanisolatedbyourlaboratoryColleagueinmarineyeast(IdentifiedbyCABIBioscienceIdentificationServicesasRhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman)toenhancetheeffectivenessofitsbiologicalcontrolofpostharvestdecaysoffruits.
(1)InvivotestresultsshowedthatR.paludigenuminducedbychitincanincreaseitsbiologicalcontrolofpostharvestdiseases(BCPD)effectsignificantly.
(2)Theoptimalconcentrationforinductionwas1.0%(wv),theoptimaltimeforinductionwas36~48chitinandNaClontheBCPDofR.paludigenum.
(3)DatashowedpopulationandgrowthspeedofR.paludigenuminwoundsofappleandpearincreasedsignificantly.
(4)DatashowedthatR.paludigenumculturedinmediumwithchitinNYDBoffruitresistanceandassociatedbiologicalcontrolresultsshowingthatR.paludigenumcouldstimulatetheresistanceoffruitsagainsttheexternalinfection.Meanwhile,chitincouldimprovetheirabilitytoinhibitthedecayincidenceandfruitresistance.Theabilitytostimulatefruit’sPODactivitymayberelated.
Inconclusion,R.paludigenuminducedbychitincouldincreaseitsBCPDeffect.ThepromotingofR.paludigenum’sgrowthinfruitwounds,secretingofantimicrobialsubstancesandinducedresistanceoffruitafterbeinginducedmaybethemechanism.
Keywords:
R.paludigenum;Chitin;Induction;BCPD
摘要Ⅰ
ABSTRACTⅡ
第一章文献综述1
1.1我国水果产业发展概述1
1.2果蔬采后病害的侵染研究1
1.2.1采后病原真菌的侵染方式1
1.2.2采后病原真菌的致病机理2
1.3果蔬采后病害的控制方法2
1.3.1化学杀菌剂的使用3
1.3.2果实采后病害防治物理方法3
1.3.3果实采后病害生物防治4
1.4采后拮抗酵母作用机制4
1.4.1营养和空间的竞争4
1.4.2重寄生作用5
1.4.3胞外活性物质的产生5
1.4.4诱导抗性6
1.4.5抗生作用6
1.5拮抗菌生理调控及机理的研究7
1.5.1逆境培养7
1.5.2拮抗物质的分泌和积累8
1.5.3基因工程技术的应用8
1.6本课题研究目的8
1.7应用前景和学术价值9
第二章海洋酵母R.paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究10
2.1前言10
2.2实验材料和方法10
2.2.1主要仪器10
2.4讨论20
致谢32
参考文献33
附录37
第一章文献综述
1.1我国水果产业发展概述
水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源,是人们维持身体健康,增进营养必不可少的主要食品,是世界上仅次于粮食的农产品。
中国是世界水果生产大国,总收获面积和产量以及多种水果的产量均居世界首位。
蔬菜、水果产业是我国国内仅次于粮食产业的第二、第三大产业。
2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示,2006年我国水果总产量为17050万吨。
据2010年初步统计,2009全国水果面积约1.6亿亩,与上年基本持平,产量1.2亿吨,同比增9%。
根据联合国粮食组织对50多个国家的调查,发展中国家水果收获后的平均损失率在30%以上。
我国水果因采后处理技术落后,作为产量第一大国,水果腐烂损失也高居全球榜首。
根据一般保守的估计,我国水果采后损失为20%~30%左右。
据此估算,我国每年水果采后的经济损失将达到数百亿元人民币的水平。
导致果实采后损失的因素很多,主要包括:
(1)由于采前栽培管理、采收和采后处理技术不当而造成的损失;
(2)由于果实采后水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质劣变而引起的损失;(3)由于采后逆境造成的果实生理代谢失调而引起的损失;(4)由于采后成熟衰老造成果实组织结构崩溃而引起的损失;(5)由于病原物侵染造成的腐烂损失等。
由各种病原物引起的植物病害每年都给各国经济造成重大的损失,其中又以真菌性病害最为严重。
据估计,仅美国每年由真菌性病害造成的经济损失就达330亿美元(Maor和Shirasu,2005;Strange和Scott,2005)。
真菌也是引起采后果实病害的主要病原物(Sholberg和Conway,2004)。
病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失,而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能会引起严重的食品安全问题,如曲霉菌(主要是Aspergillumsflavus和Aspergillumsparasiticus等)产生的黄曲霉毒素、扩展青霉(Penicilliumexpansum)产生的棒曲霉素(patulin)等(Martinsetal.,2002;Sholberg和Conway,2004;Dombrink-Kurtzman和Blackburn,2005;Brodhagen和Keller,2006;Moralesetal.,2007)。
1.2果蔬采后病害的侵染研究
由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。
病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失,而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能引起严重的食品安全问题。
1.2.1采后病原真菌的侵染方式
采后病原真菌主要通过3种途径或方式入侵果实:
(1)通过机械伤或虫害等造成的伤口;
(2)通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位;(3)通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制(Prusky和Lichter,2007)。
病原菌孢子一旦接触伤口组织,侵染就开始了(Janisiewicz和Korsten,2002;Prusky和Lichter,2007)。
而在没有伤口等便利的入侵途径的情况下,许多采后病原真菌的孢子可能会长时间潜伏在果实表面,直到果实成熟和衰老后才发起对果实的攻击(Prusky和Lichter,2007)。
1.2.2采后病原真菌的致病机理
采后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理,但其最终目的都是成功的侵染寄主。
病原真菌分泌产生的寄主细胞壁分解酶是研究较多、机理较为明确的重要致病因子,其主要包括多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶裂解酶(pectayase)、木聚糖酶(xylanases)、木糖苷酶(xylosidase)、蛋白酶(protease)、葡聚糖酶(glucanases)、漆酶(laccase)等(Sánchez-Torres和González-Candelas,2003;Akimitsuetal.,2004)。
这些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染机制和过程,如渗透、组织泡软、营养获得、改变寄主生理等(Sánchez-Torres和González-Candelas,1996;Akimitsuetal.,2004)。
1.2.2.1致病菌酸化果实组织
P.expansum、P.digitatm和P.italicum等酸性病原真菌能产生柠檬酸和葡萄糖酸等有机酸,使寄主果实组织发生酸化,进而促进病原菌致病因子,如PG基因(pepgl)的表达(Pruskyetal.,2004)。
1.2.2.2致病因子CAT
活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)在植物和微生物相互作用过程中具有重要作用(Torresetal.,2006)。
最近,中科院植物所Qin等(2007)利用蛋白组学技术发现,硼酸盐抑制扩展青霉的机理与硼酸盐抑制该真菌体内参与清除ROS的过氧化氢酶(Catalase,CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferase)等有关,暗示扩展青霉产生的CAT等可能也是该病原菌的一个致病因子。
1.2.2.3病原菌破坏植物自身防御机制
植物在遭到病原菌侵染时,通过体内木质素和羟脯氨酸糖的沉积,植物抗菌素的积累,蛋白质酶抑制剂和溶菌酶的合成来增强细胞壁的保卫反应。
另一方面,病原真菌在侵染过程中能诱导激发果实组织的形态和生理、分子水平发生显著变化(Kimetal.,2001;Sánchez-TorresandGonzález-Candelas,2003)。
目前的一些研究显示,病原菌能够刺激果实SOD、PAL、POD等与抗病性密切相关的酶活性,分解果实自身抗菌物质,诱导果实几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶活性,以及刺激相关基因的表达(Yakobyetal.,2001)。
1.3果蔬采后病害的控制方法
果蔬贮藏保鲜是果蔬生产减损、保值和增值的关键因素。
特别是当果蔬受到机械损伤后,病原菌更容易进入伤口,导致病害的发生,所以有必要利用一些防治手段保护这些损伤位点,防止果蔬在储运过程中进一步的腐烂变质。
根据国内外的研究报道,控制采后病害非杀菌剂的方法主要可分为生物学方法、物理方法和化学方法3大类。
1.3.1化学杀菌剂的使用
目前,化学杀菌剂是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。
化学杀菌剂在全世界范围广泛使用,在欧洲和亚洲占农药市场的26%,但在美国只占6%。
随着国家经济发展和消费水平的提高,人们对食品安全和环境保护意识的增强,化学杀菌剂的使用范围越来越受到限制。
有许多研究报道,化学杀菌剂具有一定的毒副作用。
美国国家科学院(NAS)的报道(1987)指出,杀菌剂的应用造成了人类健康的危害性,全美9种致瘤化合物的销售量占所有杀菌剂的90%左右,在用于食品的全部农药中,杀菌剂构成60%的致癌危险。
这一报道导致了几种杀菌剂如克菌丹(Captan)和苯菌灵(Benomyl)等被美国环保机构所禁用,并部分或全部的自动退出采后应用市场。
此外由于长期使用杀菌剂,病原菌进化并产生了大量抗药性菌种。
因此,找到一种新的安全的可以替代化学杀菌剂,控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意义。
1.3.2果实采后病害物理防治
果蔬采后病害防治物理方法主要有:
热处理;低温冷藏;微波处理;气调;辐射处理;低压处理。
低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用,热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。
低温冷藏是一种常用的保鲜技术。
近几年来,低温冷藏技术又有新的发展,采用临界点低温高湿存储,即控制在物料冷害点温度以上0.5℃~1℃和相对湿度为90%~98%的环境中存储保鲜果蔬。
果蔬果实在不发生冷害的前提下,采用尽可能低的温度可以有效地控制果蔬果实在货架期内的呼吸强度,使某些容易腐烂的果实处于休眠状态;其次采取相对高湿的环境可有效降低果蔬水分蒸发而减少失重(刘忆冬等,2005)。
冷藏技术最大的局限性在于低温只能抑制病原菌,不能根除,而且一些热带、亚热带果蔬果实在低温下冷害情况严重(任红等,2007)。
由于低温贮藏、辐照处理和热处理等物理方法都需要特定的设备,这些方法在执行起来受到成本、产地、运输条件等限制。
目前,在经济发达地区,低温贮藏链结合化学杀菌剂是比较成熟的商业采后处理技术。
1.3.3果实采后病害生物防治
从可持续发展的角度出发,开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。
例如在美国,有机产品的产值已从1997年的35.7亿美元增长到了2005年145亿美元(Prangeetal.,2006)。
利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物进行生物防治的方法近10年来已经取得了突破性的进展,被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一(Janisiewicz和Korsten,2002)。
目前已经有4个基于拮抗微生物的生物防腐剂产品:
Aspire(基于拮抗酵母Candidaoleophila,美国),YieldPlus(基于拮抗酵母Cryptococcusalbidus,南非),Bio-Save10LP(基于拮抗细菌Pseudomonassyringaestrain,美国)和Avogreen(基于拮抗细菌Bacillussubtilis,南非)(Janisiewicz和Korsten,2002;Fravel,2005)。
利用拮抗酵母进行水果采后病害的生物防治具有许多其他方法无法比拟的优点:
如遗传稳定,抑菌谱广,效价高;一般不产生对人和寄主有害的代谢产物,安全性高;对营养要求低,生长快;对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力,对大多数杀菌剂不敏感,能与多种化学和物理方法相容等(Janisiewicz和Korsten,2002;Spadaro和Gullino,2004)。
它对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义,因此成为当前国内外的研究热点。
1.4采后拮抗酵母作用机制
根据已有的研究结果显示,微生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式,直接作用包括抗生作用和重寄生作用,间接作用包括营养和空间的竞争,胞外活性物质的产生和诱导抗性等。
生防通常是一个以上的机制共同作用的结果。
1.4.1营养和空间的竞争
为了抑制病原菌的侵染,拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内在果实表面侵染部位占据优势。
拮抗菌与病原菌争夺的营养物质主要是碳水化合物、氮源等。
Filonow(1998)用14C标记的果糖、葡萄糖、蔗糖检验在苹果伤口处的拮抗菌罗伦隐球酵母(C.laurentii)、掷抱酵母(S.roseus)与病原菌灰葡萄孢孢子在营养利用上的差别,发现拮抗菌摄取和利用14C果糖的量越大,对分生孢子萌发的抑制作用越强,说明营养竞争是重要的生防机制。
在对E.andTian,2001)。
这也反映了营养与空间的竞争可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要机理之一。
营养和空间的竞争还被认为对病原真菌的次级代谢有作用(BjornbergandSchnurer,1993;Chand-GoyalandSpotts,1996)。
环境营养对病原菌的次级代谢,包括真菌毒素的产生具有重要影响(LucheseandHarrigan,1996)。
这可能是一些酵母拮抗菌能在体外试验中抑制霉菌菌丝生长的原因之一。
比如Petersson和Schnurer(1995)发现P.anomala能在体外试验中减少P.roquefortii和亮白曲霉(Aspergillumscandidus)的数量。
1.4.2重寄生作用
许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶(几丁酶,β-1,3-葡聚糖酶等),从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体。
Gravese等(1998)报道P.anomalaK对抑制苹果灰霉病非常有效,因为灰葡萄孢细胞壁能诱导其在苹果伤口上分泌的胞外β-1,3-葡聚糖酶的量增加3倍。
出芽短梗霉(A.pullulans)能显著抑制苹果等水果采后多种病原菌,CastoriaR和IppolitoA等(2001)在出芽短梗霉(A.pullulans)处理过的苹果伤口上检测到了浓度更高的β-1,3-葡聚糖酶和几丁酶活性。
拮抗菌的快速定植和水果本身酶的诱导作用可能导致了胞外溶解酶的数量增加。
但需要进一步研究这些酶的来源及其在生物防治中的作用。
某些酵母菌还可以附着在病原菌上,形成对病原菌的直接寄生作用。
Arras(1996)用电镜观察到拮抗菌无名假丝酵母(C.famata)可以在病菌菌丝上定植,并促使菌丝裂解。
EI-Ghaouth(2000)发现拮抗菌C.saitoana在苹果伤口处可以紧紧吸附在灰葡萄孢的菌丝上。
这些吸附现象不能完全说明在拮抗菌与病原菌之间有重寄生作用,但可以肯定这种现象与拮抗菌的生理活动紧密联系,因为经过热杀死的拮抗菌不再有吸附现象发生。
1.4.3胞外活性物质的产生
一些研究结果显示,拮抗菌与病原菌互作时,在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。
这些胞外活性物质可能参与了拮抗菌与病原菌之间的相互作用(表1.1)。
抗生素名称
产生菌株
针对病原菌
蒿属香豆素、东莨菪亭
无名假丝酵母(C.famata)
指状青霉
毒性蛋白(killerprotein)
毕赤酵母属(Pichiasp.)
抗细菌物质
罗伦隐球酵母
(C.laurentii)
荧光假单胞菌、
Staphylococcusaureus
挥发性物质
乳酸克鲁维酵母
(Kluyveromyceslactis)
扩展青霉
表1.1主要产胞外物质菌株
1.4.4诱导抗性
近5年来,拮抗菌诱导采后果实抗性成为了生物防治的研究热点。
已有的大量研究表明,多种生防菌,包括出芽短梗霉(A.pullulans)、C.saitoana、C.oleophila、膜醭毕赤酵母(P.membranefaciens)和罗伦隐球酵母(C.laurentii)等均能诱导多种果实的抗性及抗性相关反应,提高果实自身抗性,减少采后腐烂(表1.2)(Filonow,1999,2001;Ippolitoetal.,2000)。
生防菌作为激发子,具有生物可降解和性价比高等优良特点,因此具有良好的应用前景。
1.4.5抗生作用
通过拮抗菌产生抗生素抑制病原菌作用是人们最早发现的一种拮抗机理,也是大多数拮抗细菌最主要的机制之一(表1.3)(JanisiewiczandRoitman,1988;Janisiewiczetal.,1991)。
但是,在体外试验中能产生抗生素的菌株中很大一部分不能在体内试验中产生抑菌效果,这是由两方面的原因造成的:
有些细菌只能在“invitro”环境中产生抗生素,而在“invivo”则不产生抗菌素;一些细菌不适应寄主伤口的环境,不能存活或生命力下降,因此不能产生很好的拮抗效果。
而且能在寄主上保持拮抗能力的细菌仍具有两个弊病:
首先,抗生素有可能诱导病原菌产生抗性,从而逐步降低拮抗菌对病害的控制效果;其次
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