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HDV核酶研究近况
HDV核酶研究近况
国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔
1一{l}f
HDV核酶研究近况
于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅
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第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)
了7
摘要HDV核酶为HDV双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n’)左右,呈独特的假结
样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式HDV核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒
药物
键词HDV;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用jI竹田0’】/—一
-—一J
丁型肝炎病毒(HDV)基因组为单负股
环状RNA,通过双滚环机制(doublerolling
circlemechanism)进行复制.该过程必须经
过病毒前体RNA的自我催化裂解,即必须
经过基因组核酶(genomeribozyme,gRz)
和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag.
Rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些
植物致病病毒RNA复制特点相似.HDV复
制过程中RNA的延伸,由宿主细胞RNA聚
合酶II催化;自裂产物连接成环状,可能由
宿主细胞RNA连接酶催化”.
1HDV核酶的自裂位点及最小序列
1988年,Sharmeen等用B『物延伸法
证明ag.Rz的自裂位点在C904~G903之
间.不久.Kuo等报道gRz的自裂位点在
U688~G689之间.gRz36~100(自裂位点
端和3’端分别含36nt和1.0nt)活性较
高.后来.Perrotta等通过体外试验发现g.
Rzl84和ag.Rzl84(j端分别为u和c)能
保持较高自裂活性,其序列分别对应于HDV
基因组第688~772nt和抗基因组第904~
820nt,提示HDV核酶的最小序列约85lit
左右.g.Rzl一82和ag.Rzl一79虽能充分自
*国家自然科学基金资助课题
裂,但速率大大减慢.Thill等将g.RzI84的
5端延长至5nt,去除3端第jl~68nt,得
到g.Rz5—66(g.Rz71)仍能自裂,但同等条件
下速率明显下降.
2HDV核酶切割反应的机理及产物
虽然.HDV核酶的结构与锤头状,发夹
状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理
相似.都是转酯化反应.由自裂位点3端的
2’-OH或氧原子对自裂位点处的磷原子实施
亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一
OH.倘缺乏2一OH或自裂位点5端为一脱
氧核苷酸,则不能发生自裂.
3体外HDV核酶切割反应的条件
体外HDV核酶切割反应的条件为:
①
Mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需.
其矶理之一可能是中和核酶RNA结构间的
阴性斥力.使易于折叠成活性结构.Ca,
Mn可替代Mg,有的研究甚至观察到
Ca增加反式切割的效率远高于Mgis,v].
Sr”_,CA,Ba,Co,Pb,Zn对某些诱
变株的自裂有较弱的辅助作用②一般在
65C范围内随温度升高核酶活性增加.温度
过高则因破坏HDV核酶的二级结构而使其
丧失活性.⑧有的研究观察到HDV核酶裂
国外医学分子生物学分册1999’年第2l卷第j期
解底物的速率对数在pH4~6范围内呈线性
上升,而另有研究发现某些HDV核酶的
切割速率在pH5~9.1范围内并无明显变
化,但大多数研究均提示pH7.0~7.5时核
酶活性最高.①变性剂:
G
魁-CⅢb2-:
’5ol群cJq/一
G’
1i:
i
4HDV核酶的结构模型及其结构域
g,Rz和ag.Rz二级结构相似,但与锤头
状核酶,发夹状核酶及链孢属Vs核酶不同.
迄今主要提出3种模型,即假结样结街
(pseudoknorstructure),斧头样结构(ax
headstructure),三叶草形结构(cloverleaf
structure)等模型.诱变分析,光交联,化学修
饰等研究证实假结样结构(附图)最为可
能’Ⅲ,可划分为9个结构域仅含lnt足
可发生自裂,该nt可为U,C,A,但不能为
GE]3].
4.2Stem皿
Lee等[.将g.Rzl0—66此延长2倍,不
妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵
抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明
显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的
双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作
用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活
性
4.3Stemnl
由3bp构成,5侧与stemI51侧共轴,3
侧与stemI相邻.破坏其碱基配对或改变其
序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全
无活性.所以此区结构和序列均很重要.
4.4L3.
与stemⅡ共同构成一个发夹环结构
(hairpin—loopstructure).g.Rz和ag.Rz此
区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.Rz多1个
U27.L3有较高的序列特异性+可能参与构
或活性中心其5端,特别是CZllZ4附近区
域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作
用.
4.5StemⅣ和L4
两者共同构成另一个发夹环结构体外
试验证明此区可减至4bp而对活性影响不
大.但稳定的stmⅣ结构确实有利于活性
提高,尤其是其根部的CG配对起着连接
儿/4和J4/2的桥梁作用
4.6J1/2
连接stem【和stemI,对体外自裂反应
意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去
但ag.Rz此区的8nt较保守,可能与核酶活
性调节有关.
4.7Jl/4
连接stem【与stemⅣ,其中的3个G
对核酶活性发挥很重要,若G38/40被A,C,
u取代,则核酶活性明显下降.此区的G40/
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42与位于J4/2区的G74/75的同型配对可
使核酶结构扭曲,分别使C75/76靠近切割
位点
4.8J4/2
连接stemN与stemI.对此区中G74/
75,C75/76,A77/78,A78/79的碱基修饰显
着降低核酶活性,C75/76的改变会导致核酶
活性完全丧失光交联研究也显示ag.Rz的
C76靠近切割位点.因此C75/76很可能
直接参与了催化作用.
4.9应用x线衍射技术
发现g.RzJ1/~区的G38G39可与L3
区的C22,C21形成短双链区P1.1.从而使
g.Rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddouble
pseudoknot)高级结构.
多种方法研究显示:
L3,J1/4,J4/2可能
共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现:
若在两类HDV核酶间互换L3和J4/2+则活
性均下降;但若只互换Jl/4,则活性均有不
同程度升高”
5反式HDV核酶的设计及意义
核酶的自裂是一种分子内切割反应.称
为顺式切割(cis—cleavage),核酶对底物的分
子间切割则称为反式切割(trans—cleavage).
HDV核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自
然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以
研究其反式作用的重大意义在于利用它可能
优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用.
Branch等曾以斧头型结构为基础.从
相应cDNA上分别转录出相当于”酶和”底
物”的RNA分子,在适当条件下将两者混
合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假
结样结构最接近实际结构,以它为基础的反
式作用体系可分为3类:
①”底物”和”酶”通
过stemI的碱基配对结合,”底物”相当于
stemI5侧序列;②”底物”和”酶”通过
stem口,stemⅣ的碱基配对结合,酶由
stemⅡ3侧,J4/2,stem~3侧组成;③”底
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物”和”酶通过stemI,stemⅡ,stemⅣ的碱
基配对结合,”酶”由steml5侧,stemⅡ,
L3,stemI3侧,J1/4及stemIV5侧构成,如
Lai等设计的RNA73/RNA37(底物/酶)体
系口,1个RNA37分子可切割多个RNA73
分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核
酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.
第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,
且在一定程度上可改变stemI3侧序列以
适应底物序列+因此具有用来切割异源RNA
分子的潜在价值.
6HDV核酶活性的调节
目前对HDV核酶活性的调节有这样几
点认识:
①基于HDV—RNA分子内约7O
碱基互补的事实,Lazinski等0认为互补序
列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”
的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活②
丁型肝炎病毒抗原(HDVAg)虽非HDV核
酶自裂所必需,但确能加快自裂和拼接反
应1.Razas等1”发现未感染细胞内存在一
种HDVAg类似物,能影响HDV—RNA复
制,并具有和HDVAg相互作用的潜在能力.
③新近Perrotta等通过体外试验发现ag.Rz
的第86~89nt(5,GCCA3)可与J1/z区的
第10~13nt(5UGGC3)形成一双螺旋区
P2a,对ag.Rz具有Na依赖性调节活性:
低
浓度Na(3mmol/L以下)时可显着抑制
ag.Rz活性,但若先用高浓度Na一(100
mmol/L以上)与ag.Rz适当温育后再加入
Mg,则使切割活性明显升高;HDVAg对
HDV桉酶活性的调节可能类似这一机
制.
应当指出,加强对临床分离株序列变异
的研究+可更多了解HDV桉酶在体内的结
构和功能变化+获取悻外实验研究所不能
获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解
HDV核酶结构,性质,功能具有重要意义.
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22LazinskDWel,a1.JVirol,l995{69:
l】90
23JengKSeta1.JVirol一1996:
7O:
4295
24RazasR”a1.Science,1996;274:
90
25PerrottaATeta1.JMotBioI,1998;279:
361
(1998一l1—10收稿)
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