WB实验步骤详细总结.docx

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WB实验步骤详细总结

WB实验步骤详细总结

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1.裂解

1）配裂解液：

PMSF=100：

1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μlPMSF混匀

2）称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：

1），冰上静置10min

2.匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）

在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min

3.离心（在基础4楼416室）

1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（

，

两个标记，

加少量超纯水，

号是为了离心平衡，对称放置）

1.

2.清洗玻璃板：

清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

3.配制分离胶

1）准备：

1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）

2）10%分离胶的配置：

（用50ml烧杯。

1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）

5.91ml

超纯水

4.95ml

丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效

3.75ml

Ph8.8Tris▪HCL

150μl

10%SDS

150μl

AP（催化剂促凝作用）

9μl

TEMED

混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）

4.灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止

5.水封

立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min

6.浓缩胶的配制（5%）

4.13ml

超纯水

1ml

丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效

750μl

Ph6.8Tris▪HCL

60μl

10%SDS

60μl

AP（催化剂促凝作用）

6μl

TEMED

搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min

7.电泳（电泳液最多使用两次）

1）安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）

2）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）

Mark

4μl

（Proternladder）推荐9μ，实际4μ已经足够

样品

8μl

7-10μl均可内参挑齐即可

组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪

3）连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：

黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳

先调电压至70mV，跑约20min。

（Mark跑开，分出彩带即可）

再调电压至120mV，跑约60min。

（不能跑过下面的玻璃板）

注：

Mark的条带从红色条带往下依次为：

70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。

用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。

放入装有转移液的皿中浸泡

8.转膜（转移液可用3-4次）

1）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。

然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）

2）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上

3）“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）

4）安装转膜装置：

黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。

加入转膜液至满（否则仪器无法启动）

5）打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰

转膜成功标志：

胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色

9.封闭

1）

配制5%脱脂奶粉：

2.5g脱脂奶粉

50mlTBST

2）将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）

10.一抗

1）用TBST配，每一格加5mlTBST，再分别加入抗体

抗体的量：

2l（Psmad2l）免抗

1:

1000

5μl：

5ml

58（分子量）

2l（Psmad2l）免抗

1:

500

10μl：

5ml

58

Jnk免抗

1:

1000

5μl：

5ml

双带

内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥

1:

5000

1μl：

5ml

36

2）膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）

3）4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）

11.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

12.二抗

1）用3%的脱脂奶粉

1.5g的脱脂奶粉

50mlTBST

2）每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:

5000，即加入1μl

注意：

吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗

3）膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）

13.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

14.

显影：

U盘

A液，B液（显影液。

4℃保存）

200μl枪+枪头（黄）

膜（置于皿中）

1）开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可

2）显影液现配现用（A液：

B液=1：

1）

3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上

4）先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。

5）每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘

试剂配方：