漆酶基因在大肠杆菌中的克隆及诱导条件优化应用与环境生物学报.docx
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漆酶基因在大肠杆菌中的克隆及诱导条件优化应用与环境生物学报
漆酶基因lac1338在大肠杆菌中的表达条件优化及染料降解初步研究*
冯娟覃炎锋李荷**
广东药学院基础学院生物化学与分子生物学系广东广州510006
摘要:
在摇瓶水平上,采用单因素试验方法,对已构建好的表达漆酶蛋白HIS-Lac1338的工程菌BL21(DE3)/pET32a(+)-lac1338的诱导表达条件进行优化,以期提高蛋白产量降低生产成本。
研究了培养温度、诱导时间、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、铜离子(Cu2+)浓度等不同条件对HIS-Lac1338表达量和活性的影响。
通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析确定最佳表达条件,用酶标仪测其酶活性。
结果显示,温度为30°C,初始菌体浓度OD600为1.6,加终浓度为0.2mmol/L的IPTG及终浓度0.5mmol/L的Cu2+,培养16h,融合蛋白表达量提高了约2.5倍,为450mg/L,是已报道的最高表达量;以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物测纯酶的比酶活为22.8U/mg。
染料降解作用显示其对刚果红和靛红有95%以上的降解能力。
研究表明,该工程菌产漆酶量高且大部分为可溶性蛋白,可以快速生产,具有较好的应用价值。
关键词漆酶;大肠杆菌;表达;条件优化;染料降解
CLCQ936:
Q78
Optimizationoftheexpressionofthegenelac1338encodinglaccaseinEscherichiaColianddegradationtodifferentdyes
FENGJuanQINYanFengLIHe**
DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,GuangdongPharmaceutialUniversity,Guangzhou510006,China
Abstract
Objectives:
Inordertoimprovetheexpressionleveloflac1338geneinEscherichiacoli,fourfactorsforproducingHIS-Lac1338byrecombinantstrainBL21(DE3)/pET32a(+)-lac1338:
culturetemperature,inducingtime,thefinalconcentrationofinductorIsopropylbeta-D-thiogalactopyranoside(IPTG)andCu2+,wereinvestigated.Theoptimizedfactorsweredeterminedbysinglefactoranalysisexperiments.
Methods:
Theoptimumexpressionconditionswereanalyzedbysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,meanwhiletheactivitiesweredetectedbyenzyme-labeledinstrument.
Results:
BL21(DE3)/pET32a(+)-lac1338cellsinducedundertheoptimizedconditions(incubationat30°C,atainitialbacteriadensityofOD6001.6,inductionwith0.2mmol/LIPTGand0.5mmol/LCu2+for16h)resultedintheaccumulationoflargeamountsofsolublelaccase.Thecultureprovided450mg/Loflaccase,whichwasincreasedby250%comparedtothatundertheoriginalfermentationcondition.Itsactivitywasdeterminedbyitsone-steppurificationthroughHis-Binding-ResinaffinitychromatographyandthespecificactivitytoABTSundertheoptimalconditionscouldreach22.8U/mL.Itsdegradationtodifferentdyeshoweditcoulddegrademorethan95%ofCongoredandIndigocarmine.
Conclusions:
Overall,theoptimizedprocesstoexpressHIS-Lac1338inE.Coliprovidedhighamountsofsoluble,
andactiverecombinantprotein.Thehighexpressionyieldpermitsfastandeasyproductionforfurtherbasicandappliedresearch.
Keywordslaccase;Escherichiacoli;expression;optimizationofconditions;degradationtodyes
CLCQ936:
Q78
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,最早是从日本的漆树汁中发现的[1],在植物、真菌、细菌中广泛存在[2]。
随着漆酶功能的逐步发现,漆酶的研究受到普遍的重视,它在降解木质素方面的功能[3-4],使其在制浆造纸工业,特别是纸浆生物漂白方面得到深入的研究和开发;在生物能源的开发利用方面应用广泛,如利用漆酶降解木质纤维原料中的木质素,用于提高纤维素水解成单糖的效率及生产乙醇等新能源[5];在环保方面具有很大的应用潜力,如可去除有毒的非酚类[6]、除草剂、杀虫剂[7]、合成有机物[8-9]、石油工业废物等物质的毒性。
近年来对细菌漆酶的研究越来越深入,它相比真菌漆酶有很多优势,如耐高温,耐高pH等,使其在环境治理方面有更广阔的研究和应用前景。
目前限制漆酶广泛应用的重要因素是:
重组蛋白大多以包涵体形式表达、表达量不高、表达温度低于常温等,导致漆酶产量低、价格昂贵,实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径。
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)漆酶基因cotA在大肠杆菌E.coli中表达,但大部分是包涵体,只有10%是可溶性蛋白[10];此外,地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)漆酶基因cotA,在不同的温度下诱导表达,发现18°C诱导时酶活性最高[11],然而低温条件不适合大规模生产,因此常温诱导可溶性重组蛋白有重要意义[12]。
叶茂等人研究的漆酶基因lac159,最高表达量为380mg/L[13],仍然不能满足工业应用,所以优化表达条件获得漆酶高表达量是一个亟待解决的问题。
本研究中lac1338(GenBank,登录号HM623889)来源于海洋宏基因库,与所有漆酶基因的序列一致性低于40%,为一个新型基因。
将该基因构建到重组质粒pET-32a(+)并转化入EscherichiacoliBL2l(DE3)中诱导表达,探索在不同诱导条件下融合蛋白的表达量及对底物ABTS的相对活性双重指标,探索最佳表达条件,并研究其对不同染料的降解情况。
研究结果对于扩大发酵生产漆酶具有一定的参考价值,同时为尽快生产出拥有自主知识产权及低成本的漆酶打下基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒重组质粒pET-32a-lac1338为本实验室构建并保存,EscherichiacoliBL2l(DE3)为本实验室保存。
1.1.2主要试剂和仪器胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒购于Omega;蛋白纯化试剂盒购于德国Novagen公司;170Mr/103PrestainedProteinLadder购自广州赛哲生物科技有限公司;2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)购于Amresco公司;IPTG、氨苄青霉素购自TaKaRa公司。
其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1漆酶的诱导表达将重组质粒pET-32a-lac1338转化入EscherichiacoliBL2l(DE3)感受态细胞,挑取单菌落接种到含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中,37°C、200r/min过夜培养。
次日按1%比例接种到LB培养基(含Amp)中,37°C、220r/min振荡培养菌液至OD600为1.6,加入IPTG至终浓度0.2mmol/L及Cu2+至终浓度0.5mmol/L,30°C诱导16h;4°C、10000r/min离心3-5min,收集菌体,冰浴进行超声波破碎细胞(振幅设为300W;超声循环为:
超声5s,间隔5s,时间设为4min);4°C、12000r/min离心10min,分别取上清和沉淀煮沸5-10min;4°C、12000r/min离心10min,进行SDS-PAGE电泳检测(浓缩胶为5%,分离胶为10%)。
1.2.2融合蛋白表达量的测定采用多功能荧光分析系统及Image-lab软件对SDS-PAGE电泳结果进行分析,灰度扫描测定目的蛋白的百分比含量及OD值,以确定其相对含量及绝对含量。
1.2.3漆酶表达条件的优化分别在不同的温度、IPTG浓度、诱导时间、Cu2+浓度及不同的初始菌体浓度条件下对漆酶进行诱导表达。
通过SDS-PAGE电泳和酶活测定结果探索诱导条件对目的蛋白表达量的影响。
1.2.4重组漆酶HIS-Lac1338的纯化参见His•Bind®PurificationKit(Novagen)试剂盒说明书。
1.2.5目的蛋白浓度测定采用BCA法测定蛋白质浓度,以牛血清白蛋白作为标准对照。
标准曲线如图1,标准方程为y=0.0347x+0.0142,R2=0.992。
图1蛋白质标准曲线
Fig.1Thestandardcurveofprotein
1.2.6酶活测定以ABTS为底物,使3ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)的反应体系中含5mmol/LABTS、6mmol/LCu2+和一定浓度的酶液样品,将其混合均匀后于55°C水浴反应3min,测OD420值,同时做不加酶液的空白对照。
ABTS的摩尔消光系数ε=36,000M-1cm-1。
该条件下,每分钟催化1μmolABTS氧化所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
U=(0.1844×OD420)×V1×N/V2×t。
y=0.1844x为ABTS自由基浓度与吸光度值的关系曲线[14];V1:
反应总体积;V2:
测定酶活时所取的酶液体积;N:
酶液稀释倍数;
1.2.7HIS-Lac1338对染料降解的研究漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,研究表明漆酶在染料废水处理方面具有良好的应用潜力,因此研究重组漆酶HIS-Lac1338对染料的降解作用及条件对其在染料工业中的应用有着重要意义。
本文考察了HIS-Lac1338对多种工业染料(苋菜红,靛红,溴酚蓝,酸性紫7,结晶紫,橙红G,刚果红,罗丹明B,亚甲基蓝,考马斯亮蓝G250)的降解作用。
以不加酶液为空白对照,37°C摇床过夜(16h),并同时考察了Ca2+与小分子介体ABTS对降解率的影响。
降解率I=(A0-A1)/A0×100%。
I,降解率;A0,空白对照染料的光吸收值;A1,反应体系样品染料的光吸收值。
2结果与分析
2.1漆酶表达条件的优化
2.1.1诱导培养温度的优化融合蛋白分别在20°C、25°C、30°C和35°C下诱导表达。
结果如图2,不同的培养温度对融合蛋白表达量和活性有较大的影响,当诱导温度达到30°C时,可溶性目的蛋白的表达量达到峰值;诱导温度高于30°C时,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。
以ABTS为底物,测定各个诱导温度时的HIS-Lac1338酶活性,如图3,诱导温度为30°C时HIS-Lac1338的酶活最大,所以选取30°C为最佳诱导温度。
图2重组漆酶HIS-Lac1338的最佳诱导培养温度。
M,Marker;Lane1,3,5,7:
20°C,25°C,30°C,35°C诱导破碎后上清蛋白;Lane2,4,6,8:
20°C,25°C,30°C,35°C诱导破碎后沉淀蛋白
Fig.2TheoptimalinductiontemperaturesofHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1,3,5,7:
Thesupernatantproteininducedat20°C,25°C,30°C,35°C;Lane2,4,6,8:
Thesupernatantproteininducedat20°C,25°C,30°C,35°C
图3不同诱导温度诱导后的HIS-Lac1338的酶活检测及可溶性蛋白含量
Fig.3RelativeactivityofHIS-Lac1338expressedafterdifferenttemperatureandpercentageofsolubleprotein
2.1.2诱导培养时间的优化融合蛋白HIS-Lac1338分别诱导表达0、2、6、8、12、16、18、20、35h,由图4可知,诱导时间为16h时蛋白表达量最大,继续延长诱导时间,蛋白表达量无明显变化甚至降低。
以ABTS为底物,分别测定诱导不同时间的HIS-Lac1338酶活,结果如图5,诱导16h的HIS-Lac1338酶活最大,继续增加诱导时间,酶活逐渐降低,所以选取16h为最佳诱导时间。
图4重组漆酶HIS-Lac1338的最佳诱导培养时间。
M,Marker;Lane1-9:
诱导时间分别为0,2,6,8,12,16,18,20,35h的蛋白样品
Fig.4TheoptimalinductiontimeofHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1-9:
thesupernatantproteininducedfor0,2,6,8,12,16,18,20,35h
图5不同诱导时间诱导后的HIS-Lac1338酶活检测及可溶性蛋白含量
Fig.5RelativeactivityofHIS-Lac1338expressedafterdifferentintervalsandpercentageofsolubleprotein
2.1.3IPTG诱导浓度的优化实验采用不同浓度IPTG(0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.5mmol/L)进行诱导表达,结果如图6,不同的IPTG浓度对融合蛋白表达量影响不大;以ABTS为底物,对各样品进行酶活测定,由图7可知,当IPTG终浓度为0.2mmol/L时酶活最高,所以选择IPTG浓度为0.2mmol/L为最佳诱导浓度。
图6HIS-Lac1338的最佳IPTG诱导浓度。
M,分子量标准蛋白;Lane1-8:
IPTG终浓度分别为0,0.025,0.05,0.075,0.1,0.2,0.3,0.5mmol/L诱导时破碎后的上清蛋白;
Fig.6TheoptimalconcentrationofIPTGofrecombinantHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1-8:
thesupernatantproteinof0,0.025,0.05,0.075,0.1,0.2,0.3,0.5mmol/L;
图7IPTG浓度诱导后的HIS-Lac1338酶活测定及可溶性蛋白含量
Fig.7RelativeactivityofHIS-Lac1338inducedbydifferentconcentrationofIPTGandpercentageofsolubleprotein
2.1.4诱导Cu2+浓度的优化在不同Cu2+浓度0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mmol/L下诱导HIS-Lac1338表达,SDS-PAGE电泳结果如图8。
以ABTS为底物,测定不同Cu2+浓度诱导后的HIS-Lac1338的酶活,结果如图9。
由图可知,虽然Cu2+浓度为0、0.1、0.25mmol/L时的蛋白表达量与0.5mmol/L时相差不大,但酶活相差很大,进一步说明漆酶的活性位点需要Cu2+;但当Cu2+浓度增加至1.0mmol/L,2.0mmol/L时HIS-Lac1338表达量大大降低,推测原因是Cu2+浓度太高抑制了菌体的生长。
所以选取0.5mmol/L为最佳诱导Cu2+浓度。
图8HIS-Lac1338的最佳Cu2+诱导浓度。
M,Marker;Lane1-6:
Cu2+终浓度分别为0,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0mmol/L诱导破碎后的上清蛋白;
Fig.8TheoptimalconcentrationofCu2+ofHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1-6:
thesupernatantproteinof0,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0mmol/LCu2+
图9不同浓度Cu2+诱导后的HIS-Lac1338的酶活检测及可溶性蛋白含量
Fig.9RelativeactivityofHIS-Lac1338inducedbydifferentconcentrationofCu2+andpercentageofsolubleprotein
2.1.5加诱导剂时的初始菌体浓度在不同的起始菌体密度OD600为0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0时加IPTG和CuSO4,超声破碎菌体,SDS-PAGE电泳结果如图10。
以ABTS为底物测定不同起始菌体密度时的HIS-Lac1338活性,结果如图11。
由图可知,当起始菌体密度OD600为1.6时加入诱导剂,蛋白表达量最大及酶活均为最高,所以选取起始菌体密度OD600为1.6作为最佳起始密度。
图10加诱导剂前的最佳起始菌体浓度。
M,Marker;Lane1-7:
菌体浓度为OD600为0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0时诱导破碎后上清蛋白;
Fig.10TheoptimalconcentrationofinitialcelldensityofHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1-7:
thesupernatantproteinof0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0OD600;
图11不同起始菌体密度诱导后的HIS-Lac1338的酶活检测及可溶性蛋白含量
Fig.11RelativeactivityofHIS-Lac1338afterinductionatdifferentinitialcelldensityandpercentageofsolubleprotein
2.2重组漆酶HIS-Lac1338的纯化及蛋白浓度测定
重组菌株BL21/pET-lac1338在含氨苄青霉素的LB液体培养基培养,加入IPTG至终浓度0.2mmol/L,及CuSO4至终浓度0.5mmol/L,30°C诱导16h,离心收集菌体,用超声波破碎至澄清,上清液即为粗酶液。
粗酶液按His•Bind®PurificationKit(Novagen)试剂盒说明书纯化,产物进行SDS-PAGE检测,见图12。
如图,纯化后的重组漆酶HIS-Lac1338为单一的条带,分子量约为67Mr/103(其中18Mr/103为表达载体上的融合蛋白标签),与理论预测蛋白分子量相同。
根据蛋白标准曲线计算得纯化后的HIS-Lac1338的浓度为0.25mg/ml,酶活测定显示纯化后的HIS-Lac1338酶活为5.7U/ml,比酶活即为22.8U/mg。
图12纯化后重组漆酶HIS-Lac1338的SDS-PAGE电泳。
M,Marker;Lane1-3:
纯化后重组蛋白HIS-Lac1338
Fig.12SDS-PAGEanalysisofpurifiedHIS-Lac1338.M,Marker;Lane1-3:
purifiedHIS-Lac1338
2.3HIS-Lac1338对染料降解的研究
HIS-Lac1338对10种染料的降解效果如图13所示,由图可知,当添加Ca2+时能有效促进HIS-Lac1338对染料的降解能力(单独使用HIS-Lac1338时并不具备降解能力);当同时添加Ca2+和小分子介体ABTS时,其对染料降解能力得到一定的增强,对刚果红及靛红的降解率达95%以上,对溴酚蓝也有50%以上的降解率,但对结晶紫,橙黄G,罗丹明B未见有明显的降解能力。
图13HIS-Lac1338对不同染料降解情况比较
Fig.13ComparisonofdegradationrateofHIS-Lac1338todifferentdyes
3讨论
研究表明,低浓度IPTG和低温条件可以提高可溶性蛋白的表达量[15],但由于低温诱导表达重组蛋白不宜大规模工业生产,因此常温诱导产生可溶性的重组蛋白有着极其重要的意义[16]。
本研究中培养温度为30°C时蛋白表达量较高且活性最高,适宜常温大规模生产;诱导剂IPTG浓度对融合蛋白HIS-Lac1338表达量及活性影响较小,本研究采用低浓度0.2mmol/L,即可达到理想效果。
在漆酶蛋白诱导表达过程中,添加外源铜离子不仅能辅助漆酶蛋白的正确折叠,提高漆酶的活性,还有助于提高漆酶的稳定性[17]。
研究表明Cu2+浓度为0mmol/L,0.1mmol/L,0.25mmol/L时的蛋白表达量与0.5mmol/L时相差不大,但酶活差别很大,进一步说明漆酶的活性位点需要Cu2+。
DubéE等研究的源于链霉菌属Streptomycescoelicolor的漆酶在宿主链霉菌属StreptomyceslividansLAF10-164异源表达,34°C培养72h蛋白量达到350mg/L[18];而Koschorreck等
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