实验八聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳docx.docx
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目的与要求
•学握聚丙烯酰胺凝月交电泳分离血清蛋白质的
原理;
❖熟悉聚丙烯酰胺凝朋^电泳的实验方法弄口操作
技术。
实验原理
电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。
电泳技术根据支持物的不同可分为:
纸电泳、醋酸
纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳
及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
直平板电泳。
垂直板式电泳槽水平板式电泳槽
柱状电泳槽
电泳分离原理
♦:
•在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点所
带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积。
F=QE
质点的前移同样要受到阻力(Fz)的影响,对于一个球形质点,月艮从Stoke定律,即:
Fz=6兀r〃v
式中r为质点半径,Y]为介质粘度,v为质点移动速度,当质点在电场中作稳定运动时:
F=F即QE=6thT|V
vr6Trrq
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺弄口亚甲基双丙烯酰胺
在催化剂作用下,聚合交联而成,具有网状立
体结构的凝胶。
并以此为支持物在垂直的玻璃
置有两种不同的凝胶层:
浓缩胶、分离胶。
•聚丙烯酰胺凝月交是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两
tetramethvlethylenediamine,简称TEMED)和催化剂过硫酸胺(NH4)2(SO4)2(Ammoniumpersulfate简称AP)(或光敏物质如核黄素,在紫外光、曰光灯、普通宇乌灯.日光照射下产生自由基),共同作用下
聚合而成。
❖聚合反应是由溶于水的AP产生自由^S208--^S04-自由基S0「,催化TEMED使之成为带不成4电子的活化分子,活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合并转移自由基使之活化。
被活化的Act可以同样的方式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化,如果反应物中只有Act分子,按反应机理可以使所有Acr分子结合成长链,使其末端的Act分子始终带有被转移的自由基活性,但仅Act分子的多聚体只能形成长链,尽管呈黏稠状,但不能形成带孔的凝胶。
•Bis是由两个Act分子靠甲叉基相互连接构成。
Bis中的两个丙烯酰胺都可以分别被TEMED活化成为活化分子,而后又去不断地结合和活化其他Act分子,形成长链;或者分别被已形成长链的Act活化连接;或者一边被TEMED活化后与Act形成长链,另一边与已合成的Act长链结合等,其反应是随机的,多样的,但无论如何反应,在形成的Act长链之间由于Bis的纵链而被连接起来,形成立体的网状结构。
Bis是一种弓I入纵链的交联剂。
这样,按一定比例的Act和Bis在TEMED、AP的作用下就形成具有立体多孔.多分枝网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
ch2=ch
上1
严rm
CH.-=CH
21
ch2
c=o
1
+护催化剂
™2
1?
c=o
ch2=ch
Acr
Bis
-CH2-CH-CH2-CH_CH2-CH
C=O
c=o
c=o
NH2
14H
1
ch2
NH
1
c=o
c=o
c=o
_C巧—CH_CHq—CE—CH2—CH
PAA'
丙烯酰胺(Acr)
交耳关剂:
甲叉双丙烯酰胺(Bis)
催化剂:
过硫酸皱(化学法)核黄素i光化法)
活化剂:
TEMED(N,N,N',N'-
四甲基乙二胺)
8.3
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
系统的不连续性表现在以下几个方面:
1.凝胶由上、下两层凝胶组成,两层凝胶的孑C径不同,上层为大孑C径的浓缩胶,下层为小孑C径的分离胶。
2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
电极缓冲液为pH&3的Tris-甘氨酸缓冲液,浓缩胶为pH6・7的Tris-HCl缓冲液,而分离胶为pH&9的Tris-HCl缓冲液。
3.在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里,存在三种物理效应,即样品的浓缩效应,凝胶的分子筛效应和电荷效应,由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。
浓缩效应
•样品在电泳开始时,通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍),然后再被分离。
当通电后,样品进入浓缩胶中,解离度最大的一有效迁移率最大,被称为快离子,解离度次之的蛋白质则尾随其后,解离度最小的甘氨酸离子(PI=5.97)泳动速度最慢,被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动,在其后边形成了低离子浓度区域,即低电导
III
区。
电导与电势梯度成反比,因而在快、慢离子间形成了局部较高的电位梯度。
处于该高电位梯度下的血清蛋白质各成分以不同速度(分子量和带电量不同)泳向快离子区,后又急速减慢,因而就按其
分子的大小堆积浓缩成层。
电荷效应
子的电泳迁移率很快赶上蛋白质,高电势梯度也随之消失,在均一电势梯度和pH的分离胶中,由于各种蛋白质的等电点不同,所带电荷量不同,在电场中所受引力亦不同,经过一定时间电泳,各种蛋白质就以一定川页序扌非列成一条条蛋白质区带。
分子筛效应
•由于分离胶的孑C径较小,分子量大小或分子形状不
分子走在前面,大分子走在后面,各种蛋白质按分
子大小顺序扌非列成相应的区带。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系
•聚丙烯酰胺凝月交聚合的催化体系有两种:
化学聚合(AP);光聚合(核黄素)
用核黄素进行光聚合的优点是:
①核黄素的用量很低;②通过光照可以预定聚合时间。
但光聚合的凝月交孑C较大,而且随日寸间延长而逐勺斩变小,不太稳定,所以用它制备大孑C凝胶较适合。
化学聚合的凝月交孑C径较4、,因而采用过硫酸胺一TEMED催化系统制备小孔凝胶(分离胶),而且各次制备的重复性好。
考马斯亮蓝Coomassiebril1iantblue
❖在蛋白质染色中,目前考马斯亮蓝染色法最为常用,1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色,它步骤简便、灵敏度较高,可进行定量扫描。
它可分为R和G型两类。
R250比考马斯亮蓝G250少二个甲基,但是比G250灵敏度高。
•:
•染色原理:
染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基通过范德华力结合。
在595nin下测得的吸光度,与蛋白质浓度成正比。
试剂及器材
两种月交的储备液,电极缓冲液,染色液,脱色液,凝胶电泳玻璃管,注射器(10cm长注射针头),微量取样器,圆盘电泳槽,电泳仪,
0.05%漠酚蓝,马血清,40%蔗糖溶液。
实验操作
将洁净•烘干的玻璃管一端用胶布封好\插入疫苗瓶的橡皮帽上,将封闭的一端朝底垂直放于试管上。
(冷离胶和浓缩胶,毎/、人配—)
分离胶:
1、先配制分离胶,在干燥4、烧杯中加入1,2号液及水
分别为lnil.2nd和lnil,混匀
2、加入新酉己制的过硫酸铁4ml,混匀及时用滴管吸取胶液沿管壁灌入玻璃管内具管口约1.5cni处。
3、立即川页管壁加入水,以隔绝空气中的氧,力口速胶凝过程,加水时一定要防止搅乱胶面。
4、待约30inin即凝集成胶,弃去顶上水层,可用吸水纟氏吸干。
浓缩胶:
1、按表配^制浓缩胶:
在干燥4、烧杯中先加入4,5,7号液分别为1皿1、2nd和4inl,混匀。
2、再加入6号液linl混匀,用少量该胶液冲洗分离胶面,然后用吸管吸取该胶液沿壁灌入分离胶面上层足巨管口约0・5cni处。
进行光化作用,约30inin后聚合完全。
待胶凝好后,将封闭物取下,将胶管安到电泳槽中,倒上缓冲液,检查是否漏液,液面要过管顶。
点样:
取血清100M,40%蔗糖lOOlLtl,漠酚蓝100M于
白磁盘中混匀,上样15M。
电泳:
浓缩胶时电压80V(约40min),分离胶160V(约3h)o
待漠酚蓝快到管口时停止电泳,倒出缓冲液。
取胶:
带长针头的注射器吸水,沿管壁慢慢插入同
于试管中。
不要用力过猛,且试管应先放些水,以
防止胶断裂。
染色:
将试管里水倒掉,加入染色液,染色40mino
脱色:
倒出染色液,加入脱色液,更换3次脱色液每次脱色lOinin,然后隔一天换一次脱色液,直到蛋白带清晰为止。
观察管状胶条染色条带。
注意事项
1•丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性,尽
量避免吸入和接触。
2•考马斯亮蓝染色、脱色,染液回收。
3.电泳注意正负极。
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