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酶学0828
酶学
酶是一种具有催化活性的蛋白质,即使在发现具有催化活性的核酶后,这一酶的定义依然为一般生化学家所接受。
酶和一般蛋白质的不同之处在于它能催化各类热力学上可能进行的化学反应,使反应速度增加千倍甚至亿万倍。
并且,酶的催化作用又有一定的规律性,同时,酶学又是生物化学和分子生物学的基础,没有酶学的研究成果就不可能发展成现代的他子生物学,如没有核酸内切酶就不可能有基因工程就是一个明显的例子。
介绍酶的结构和功能,下面主要介绍酶的结构与功能:
酶结构和功能的关系实际上就是蛋白质结构和功能的关系。
过去在这方面的研究往往局限于酶结构和催化功能的关系,因而对酶分子结构的研究大多集中在分子中与催化相关的部位。
这些体外研究虽已获得了很多酶作用机制的知识,但尚无法解释酶的很多细胞生物学现象,如酶在细胞内的转运和定位等,近年来由于很多酶(特别是膜结合酶)已被克隆测序,对它们的结构域作了解析,因而对酶非催化部位的功能有了较多的了解。
本章将从酶分子解剖学和细胞生物学的角度,层次介绍酶分子结构域、模体和活性中心的功能,叙述酶在细胞中的分拣和投送。
随之介绍各个层次和酶催化功能的关系。
再从同工酶角度阐明酶结构和功能的关系,最后介绍酶学领域的几个概念。
第一节酶的分子解剖学
分子解剖学也可理解成结构生物学(structurebiology),是近年来蛋白质和酶学的一大发展。
这里着重介绍分子各组元件的结构和功能。
酶分子的结构域
结构域:
多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔和而成三级结构。
这种相对独立的三维实体就称结构域。
结构域:
作为结构单位进行相对独立运动,水解后仍能够保持一定结构,甚至保留某些活性。
但它又不等同于蛋白质的功能域,有时一个功能域由几个结构域组成。
(一)膜结合酶
很多蛋白质定位于细胞的膜质结构上。
忆发现有6型膜蛋白(图1),以不同的方式镶嵌或挂靠在膜结构的脂质中,其中不少属于酶蛋白或具有酶活力,它们大多数包含4个结构域(或区),即膜外结构域、跨膜结构域、茎区和催化结构域。
1.I型膜蛋白如存在于细胞表面的很多激素或生长因子的受体、抗原识别分子和粘附分子等,其N端在膜外,接着是一段疏水的跨膜结构域,由20~30所氨基酸组成的α螺旋10余个氨基酸组成的β折叠,肽链进入胞内后,有一段茎区连接着分子较大的C端催化结构域。
以生长因子受体为例,胞外部分是带有糖链的受体,能与生长因子结合,而胞内的催化结构域具有酪酸蛋白激酶的活性,故生长因子受体也就是受体的酪氨酸蛋白激酶。
2.Ⅱ型膜蛋白一种情况是细胞质膜上的酶,它和I型的区别主要是C端在膜外,而N端在膜内胞质中。
。
如质膜上Na+,K+-ATP酶(钠泵)的β亚基和二肽酶等。
另一情况是和细胞内膜质结构相结合的酶,其N端虽也在胞质中,但C端则伸入膜结构的管腔中。
如存在于高尔基体的糖基转移酶,其较短的催化结构域则在高尔基体的腔道中。
3.Ⅲ型膜蛋白是一类多次跨膜蛋白(不论N端或C端在膜外),包括视紫红质等和G蛋白偶联的细胞膜受体和细胞色素P450及大肠杆菌中的某种肽酶等。
4.Ⅳ型膜蛋白主要是一些跨膜的离子通道或小分子亲水物质的通道,由数个跨膜的亚基组成。
亚基间并无肽链或其他共价连接。
如神经系统中的乙酰胆碱受体和甘氨酸受体,细菌膜上的组氨酸转运系统等。
5.Ⅴ型膜蛋白膜蛋白并非嵌入膜中,而是通过糖基化的磷脂肌醇(GPI)将蛋白质锚定于脂质组成的膜中,如细胞表面的一些水解酶,包括乙酰胆碱酯酶,碱性磷酸酶和猪肾二肽酶等。
这些酶的C末端(常是小侧链残基,如Gly、Ser、Asp、Asn、Cys)羧基和磷糖的另一端则连于磷酯肌醇(PI)的肌醇-6位羟基上。
PI实际上是膜质的一部分,其长链脂酰或脂烃则牢固嵌入膜中。
6.Ⅵ型膜蛋白1996年发现了一种新型的既有多次跨膜,其以端连接GPI糖基磷酯酰肌醇的膜蛋白,目前仅发现膜桥蛋白(ponticulin)一种。
(二)非膜结合酶
这类酶存在于胞液、线粒体基质或核液等可溶性细胞成分中。
没有穿膜结构域,也不存在N端或C端的定位问题。
其主要部分是催化结构域,也可另有一个调节结构域。
前者和底物结合并起催化作用,后者则与酶的调节物(抑制剂或激活剂)结合。
对一些多亚基的酶来说,调节域和催化域可以不在同一条肽链上,而分别存在于两类不同的亚基上,称为调节亚基和催化亚基。
大多数可溶性酶也可有一个以上类似或不同的结构域,如弹性蛋白酶和硫氰酸酶(肝中催化CN-和S32-形成SCN-和SO32-的解毒酶)都含有两个十分类似的结构域,而木瓜蛋白酶则有两个很不一样的结构域。
结构域在蛋白质肽链的折叠、变构和调节等现象中具有重要作用。
不同的结构域也有不同的功能。
如在各种蛋白激酶中,除cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)有分开的催化亚基调节亚基外,这两个不同功能的区域一般都存在于一条肽链中,形成催化结构域和调节结构域,其中cGMP依赖的蛋白激酶G(PKG),钙-甘油二酯,佛波酯-磷脂依赖的蛋白激酶C(PKC)其调节结构域都位于N侧,催化结构域位于C侧,而肌球蛋白轻链激酶则其调节域在C侧。
它们的催化域(连同PKA的催化亚基)都有极大的同源性,有从N端到C端排列的ATP结合区段、AspPheGly(DFG)催化位点和蛋白质底物结合区段。
而它们的调节域则有大区别,分别与不同的激活剂结合。
大多生长因子受体的胞内酪氨酸蛋白激酶(TPK)结构域能自身磷酸化,一些带有SH2(Srchomology2)结构域的蛋白质如GTP酶激活蛋白(GAP)或磷脂酶C-γ,磷脂酰肌醇-3激酶等都能和TPK的自身磷酸化位点结合,这和生长因子的信号传导密切相关。
也有一些多功能的酶,其不同酶活力可来自不同的结构域,如大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去Mr6000的片段后失去了tRNA氨酰化的活性,而保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交换的活性,说明这两类活性由不同的结构域催化。
又如动物的乙酰CoA合成酶的亚基有生物素羧基结合蛋白(BCCP),生物素羧化酶(BC)、羧基转移酶(CT)和别构调节4个结构域。
已发现凝血及纤维蛋白溶解有关的蛋白酶由6种不同的结构域以不同的的组合方式装配而成,包括:
γ-羧基谷氨酸(Gla)域,表皮生长因子域,三环(Kringle)结构域,指(finger)结构域和接触因子(CF)域以及尖似胰蛋白酶的催化域。
由于不同蛋白酶装配不同,故在凝血或纤溶系统中的功能不同,而不同蛋白酶中的相同结构域则往往有相同或类似的功能。
这些结构域在其他蛋白质中也存在,如纤连蛋白(fibronectin)和载脂蛋白A中也存在三环域,这就不难解释为什么凝血酶原还具有促进细胞生长,促进组织纤溶酶原释放以及参与脂蛋白的代谢等功能。
因此可以把结构域看成是酶蛋白中的一个功能单位。
蛋白质前体加工酶又称蛋白质转化酶(proteingconvertase)是近年来酶学研究的热点之一。
这类加工酶的功能是将活性蛋白质或多肽的前体经水解作用切断肽键或去除一些氨基酸残基,使前体转变成活性蛋白质。
胰岛素原经蛋白质转化酶PC3和PC2分别切断B链-C肽和C肽-A链连接处的双碱性氨基酸残基(分别为ArgArg和lysArg)的C端肽键,再由羧肽酶H将碱性氨基酸去除后就生成活性的胰岛素。
前体加工酶是枯草杆菌蛋白酶家族中的一员,本身也有前体。
由信号肽、前体肽、催化域和P(又称homoB)结构域等部分组成,其中有一些尚富含有Cys或Ser/Thr区段,少数还有跨膜区或作用与跨膜区相似的两性螺旋区。
不同的区段或结构域都有各自的功能。
如17~24个氨基酸残基的信号肽可引导酶分子进入内质网膜及高尔基体网络,信号肽序列后约含100个氨基酸的前体肽,在酶分子肽链的折叠中起重要作用。
前体肽的切除是这类蛋白质转化酶成熟的必需步骤,前体肽之后是约300个氨基酸组成的催化结构域,这一区域在各种蛋白质转化酶中的同源性很大,其中最为保守的是Asp、His、Ser组成的三联电荷中继网络是S蛋白酶的活性中心,P结构域也可能在肽链折叠,酶分子在细胞内运输等过程中起作用。
二、酶分子的模体
在蛋白质的结构中模体(motif)是由数十个氨基酸组成的具有一个相对独立功能的小区,一个结构域可包括数个模体,如催化结构域可包括能和几种不同底物相结合的模体,调节结构域也可含有和不同调节物结合的模体。
但有的模体也可独立存在而不属于某个既定的结构域。
具有相同或类似的酶常含有相同的模体,如所有以ATP为底物的蛋白激酶在催化结构域中有一个22~27肽的区段,GXGXXGX15~20K(G.K.X分别为Gly、Lys和任何氨基酸),称为ATP结合模体。
另一类合成酶如氨基酰-tRNA合成酶虽也以ATP为底物,但其ATP结合模体为HIGH(HisIleGlyHis)。
蛋白激酶C(PKC)的N端1/2肽段为调节结构域,常规型PKC(包括α、βⅠ、βⅡ、γ四种亚型或同工酶)含有3个与酶活力调节有关的模体(图2):
①假底物模体PS,其中心肽段为ArgLys(或Arg、Gln)GlyAlaLen(或Ile、Val、Arg)Arg六肽,和被PKC磷酸化的底物的肽段ArgXXSerXArg基本相同,只是第4位的Ser(磷酸化位点)换以Ala,故不能被自身催化而成为假底物。
但这个假底物序列可和酶催化中心的底物结合位点相结合而阻断真底物和酶的结合。
②两个富含Cys的模体(CRR-1和CRR-2),CRR-1能和激活剂甘油二酯(DG)或佛波酯(PMA)结合,CRR-2模体中的Asn在结合中起重要作用,可增加DG或PMA的结合力。
DG或PMA和CRR模体结合后,可引起酶的变构,改变肽链的折叠状态,解除假底物序列对催化中心的阻断作用而导致酶的激活。
③钙结合模体CaBS,DG对酶的激活需要Ca2+的存在,因Ca2+和钙结合区结合后可加强酶的激活。
新型PKC(δ、ε、η、θ、μ亚型)由于缺乏CaBS模体而不受Ca2+激活,但仍受DG及磷脂激活。
PKC的C端1/2为催化区域,除有ATP结合模体(图2中的ABS)外,尚有蛋白质结合模体(PBS)和催化位点AspPheGly(DFG)。
参与寡糖链合成的各种唾液酸转移酶(ST)不论将唾液酸转移到糖脂或糖蛋白糖链(N-或O-糖链)的非还原末端,形成α2,3或α2,6键,其催化域中都有一段约50个氨基酸组成的序列,同源性很大,称为唾液酸模体(sinlylmotif),此模体和结合底物CMP-唾液酸有关。
同样,在属于α1,3半乳糖转移酶家族的三个糖基转移酶都有一个CX5-6K(R)DKKND(G)的底物UDP-半乳糖结合模体。
弗林蛋白酶(Furin)是一种蛋白质前体加工酶,它借跨膜结构定位于外侧高尔基体网络(TGN),也可存在于细胞膜及胞外基质中。
但它在胞外的停留十分短暂,可通过胞饮作用而重新返回TGN。
弗林蛋白酶的胞质结构域中有两个分开的四肽模体和酸性模体,前者是位于762~765位的YKGL,后者为774~783的CPSDSEEDEG。
四肽模体在人、鼠、牛来源的弗林蛋白酶中完全保守,且普遍存在于各种能通过胞饮途径循环于细胞膜与高尔基体之间的膜蛋白中,它们都处于相距跨膜结构域20~30氨基酸残基的胞质区。
酸性模体也可能在酶定位于膜结构中起作用。
因为一些膜蛋白,如运铁蛋白受体、表皮生长因子受体、低密度脂蛋白受体乃至溶酶体的酸性磷酸酶中也存在这类酸性模体,说明具有不同功能的酶只要有某一相同或相似的性能,就可能存在这类同源性的酸性模体。
另一有趣的例子是磷脂酶A2、磷脂酶C、蛋白激酶C和GTP酶活化蛋白(GAP)等都可和膜结合与受钙激活,都含有高度同源的Ca2+依赖性膜连接模体。
三、酶的活性中心
(一)活性中心必需基团的概念
酶蛋白的催化结构域中和底物结合并发挥催化作用的部位,称为酶的活性中心,是酶显示活性直接相关的区域。
参与活性中心的化学基团实际上就是酶蛋白氨基酸残基的侧链,有时尚包括肽链末端的基团。
这些基团在一级结构上并不互相毗邻,而往往分散在氨基酸残序列中,甚至分布在不同的肽链上。
故活性中心和模体不同,模体中的氨基酸残基一般在一级结构上是顺次相连的,而活性中心则要依靠酶分子的二、三级结构,即肽链的卷曲、折叠,包括形成肽链间的二硫键,才使这些互相隔离的基团靠近,集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
如胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ilel6、His57、Asp102、Asp194和Ser195(序号以酶原为准),它们在酶原形工时分散在一条肽链上,但酶原经胰蛋白激活后,形成A,B,C三条肽链,前三个残基在B链,后两个在C链。
但在空间结构上已互相接近,形成Asp102、His57和Ser195线性排列。
在活性中心的基团中,有的担负和底物结合的作用,称为结合基团,有的可能参与使底物转变成产物,称为催化基团,但有时结合基团也参与催化作用。
另外、还有一些辅助基团,起辅助催化基团的作用。
如电子或质子的转移等。
酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必需,故称为必需基团。
但在酶活性中心以外的区域,尚有不和底物直接作用的必需基团,称为活性中心外的必需基团。
这些基团与维持整个酶分子的空间构象有关,可使活性中心中各个有关基团保持于最适的空间位置,间接地对酶的催化活性发挥其必不可少的作用,有人称之为结构基团(或残基)。
然而,在酶的催化域中还存在一些不属于活性中心或结构基团的残基,称为非必需或非贡献基团(残基)。
例如木瓜蛋白酶中的2/3、烯醇化酶中的1/5残基属于这一范畴。
这类残基虽对酶的某一催化活性不起作用,但它们也许在种系发育的物种专一性、作为免疫原或在细胞内转移和定位、防止降解等方面起着一定的作用。
也可能它们是该酶迄今尚未发现的另一活力类型的活性中心。
因已知有些酶是多功能的,如谷胱甘肽S-转移酶主要催化谷胱甘肽(GSH)和多种脂肪族、芳香族或杂环族亲电子化合物的结合,但其某种同工酶尚有GSH过氧化酶,或者白三烯C4合成酶的活力,后两种活力和谷胱甘肽转移反应很少有相似之处,却由同一种酶催化,并且该酶尚可结合多种阴离子化合物,和胆红素等物质在细胞内的转移有关,这些功能很可能由酶分子上不同的区域来完成。
又如最近发现,猪乳酸脱氢酶M(A)亚基就是DNA螺旋解链蛋白以及神经细胞的胆碱酯酶尚有自身分解的蛋白酶功能,因此对一种酶活力而言的非贡献残基,对另一种活力(酶或非酶)也许是必需残基。
(二)酶活性中心化学基团的鉴定
了解参与酶活性中心的各种化学基团的性质对研究酶结构和功能的关系具有十分重要的意义。
一般有物理学、化学和蛋白质工程三种方法。
1.物理学方法用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物中各种基团(包括酶和底物)的相对位置,如溶菌酶是129个氨基酸组成的水解细菌壁上肽多糖的酶,肽多糖主要由乙酰氨基葡萄糖和乙酰胞壁酸(也称乙酰氨基葡萄糖-3-乳酸醚)交替连接的线性多糖和短肽交联合成。
X射线衍射图表明,此酶是一个近似椭圆形的分子,其表面有一条与分子长轴平行的沟,其长度恰巧容纲底物分子中6个糖单位,糖单位与沟壁活性中心的基团如Glu35,Asp52等以氢键相连,其中第4个糖环形成半椅式构型后与酶更紧密地结合,酶的催化作用是水解第4个糖环中的糖苷键水解。
2.化学法采用对某些化学基团有特异结合作用的化学修饰剂与酶分子活性中心中的基团共价结合,导致酶活力丧失,从而推知修饰后使酶失活的化学基团。
其中亲和标记和差别标记法虽能较特异地修饰或标记活性中心的必需基团,但化学方法有不少缺点,如只能修饰极性基团,无法区别被修饰的羧基来自Asp或Glu,氨基是ε-还是α-末端氨基,羟基来自Ser或Thr等。
如不知该酶的氨基酸顺序,也难以得知活性基团的定位(氨基酸序号)。
3.蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进方法,将酶相应的互补DNA(cDNA)定点突变,此突变的cDNA表达出只有一个或几个氨基酸置换的酶蛋白,再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为活力所必需。
本法有上述化学修饰方法无可比拟的优点:
①可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基;②可改变疏水残基,使其转变成亲水或另一疏水残基;③可同时改变活性中心内外的几个氨基酸,研究这些氨基酸之间的相互关系;④可人工造成一个或几个氨基酸的缺失或插入,了解肽链的缩短或延长对酶活力的关系;⑤可定点改变酶蛋白的磷酸化位点或糖化位点,研究磷酸化或糖化对酶结构和功能的影响;⑥不会引起底物和活性中心结合的立体障碍。
化学修饰使被修饰的氨基酸残基变大,可导致底物和活性中心结合的立体障碍。
如大肠杆菌甘氨酰-tRNA合成酶的β亚基受N-乙酰亚胺(NEM)修饰后活力丧失和NEM浓度有计量关系。
曾误认为93、395和456的半胱氨酸巯基是活力所必需的。
后来用蛋白质工程法用Mr相当的丙氨酸取代这三个半胱氨酸,酶并不失活,可见NEM的修饰失活是修饰后的半胱氨酸残基立体障碍阻碍了底物和酶的结合所致。
目前蛋白质工程法在国际上已被普遍应用。
(三)组成活性中心的重要化学基团
用化学修饰方法测出在大多数酶的活性中心上有8种氨基酸的频率最高,即Ser、His、Cys、Tyr、Try、Asp、Clu、Lys。
蛋白酶和酯酶一般含有Ser和His,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等,称为丝氨酸蛋白酶。
但也有些蛋白酶的活性中心不含丝氨酸而有半胱氨酸,如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶,称为-SH蛋白酶。
表1列举了一些酶活性中心与催化作用有关的主要氨基酸残基或基团,其中有些虽和底物结合有关,但大多数结合基团未罗列在内,如乳酸脱氢酶和NAD+或NADH结合的基团多达10个以上。
对金属酶类来说,活性中心中还有一些金属络合的基团也属于必需基团。
如羧肽酶A中与锌离子络合的His69、Glu72和His156。
表1一引起酶活性中心中的残基或基团
酶
参与活性中心的残基或基团
胰蛋白酶
His42,Asp87,Ser180
α-胰凝乳蛋白酶
His57,Asp102,Ser195,Asp194,Ile16
弹性蛋白酶
His42,Asp87,Ser180
羧肽酶A
Arg145,Tyr248,Glu270,Zn2+
核糖核酸酶
His12,Lys41,His119
溶菌酶
Glu35,Asp52
乳酸脱氢酶
Asp30,Asp53,Lys58,Tyr85,Arg101,Glu140,Arg171,His195,
Lys250
α-半乳糖苷酶
Try,His,COOH
谷胱甘肽S-转移酶(胎盘)
Cys47,Lys,Arg,His,COOH,Trp
第二节酶的细胞生物学
一、酶在亚细胞器中的定位
细胞内不同功能的酶往往被互相分隔(compartmentalization),定位于不同的亚细胞器中,而参与同一代谢通路的酶又组成酶系而常常定位于同一亚细胞结构中。
但某些物质的代谢也可在两个或更多的亚细胞器中顺序进行。
如糖酵解和糖异生酶系主要在胞液中,而丙酮酸的有氧氧化则在线粒体中进行。
脂肪酸在胞液中激活成脂酰CoA后也进入线粒体β氧化;而脂肪酸的合成则由线粒体提供的乙酰CoA在胞液中进行。
类脂质如胆固醇和磷脂的代谢酶类很多定位于光面内质网。
氨基酸分解代谢和相互转变一般在胞液,而鸟氨酸循环则起始于线粒体而主要在胞液中完成尿素的合成。
但由氨基酸合成蛋白质必须在要核糖体的粗面内质网上进行。
与ATP合成偶联的生物氧化酶系存在于线粒体中,而与生理解毒相关的氧化、还原、结合等过程则在内质网上进行。
DNA的复制和转录部分定位于细胞核,但线粒体也有少量活力。
此外,参与糖复合物(糖脂、糖蛋白中聚糖)合成的糖链加工酶除少数在内质网外,主要存在于高尔基体,负责细胞内消化的各种蛋白酶和酯酶则主要集中在溶酶体,而和H2O2生成分解有关的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶则定位于过氧化体。
(表2)
二、酶在细胞内的分拣的投送
各种不同功能的酶在细胞内互相分离,各得其所,对物质代谢在细胞内有条不紊地进行有十分重要的意义,然而,酶蛋白是几乎集中在粗面内质网上合成,这些合成后的酶蛋白是怎样被分拣(sorting)和投送(trafficking)到各种亚细胞器中去的问题就成为近代细胞生物学和酶学互相结合研究的前沿课题。
已有大量的实验提示,酶蛋白分拣、投送的信号主要存在于酶蛋白的结构中,因此这一酶的细胞生物学问题实际上也是酶的结构和功能的关系问题。
(一)酶分子的氨基酸序列在酶蛋白分拣中的作用
众所周知,分泌性蛋白质都在其N端有一长短不等的信号肽,约10余个至30余个氨基酸残基。
不同蛋白质信号肽的同源性很少,但都富有疏水性AA残基,并在N端有碱性氨基酸,这段在核糖体上首先合成的信号肽能在信号颗粒(SRP)信号肽识别体参与下,插入由脂类组成的内质网膜中,膜上还可能有信号肽的受体参与这一过程,并使核糖体-mRNA复合物贴近内质网膜。
随着肽链的延长,新生肽链不断地插入内质网膜,使之形成一线性通道,使整个新生肽链进入内质网腔,此时完成历史使命的信号肽被内质网膜上的蛋白水解酶切割下来,切去信号肽的酶蛋白则随着内质网膜形成形成微泡,向高尔基体移动并通过融入高尔基体等过程进入高尔基体,再通过高尔基体形成的分泌小泡或颗粒与细胞膜融合后借胞吐作用(exocytosis)分泌至胞外。
实验证明,如用蛋白质工程法使某一分泌性蛋白(包括酶)的信号肽序列缺失或突变,可使该蛋白的分泌受阻。
有时信号肽不一定在内质网膜腔内被切除,而保留信号肽的酶蛋白可继续穿越内质网腔而进入其他亚细胞结构,如高尔基体或细胞膜。
定位于细胞膜上蛋白质的转运一般也需要信号肽,并在信号肽的C端有一段不被切除的序列,一般为跨膜序列,对蛋白质定位于膜上起重要作用。
糖基化对一些膜蛋白的转运也是必需的,因缺乏糖基化的蛋白可因肽链折叠失常、空间构象改变或亚基不能聚合等原因而聚积在内质网中,并和一种免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)结合而被降解。
此外蛋白质的糖基化尚可起屏障保护作用,避免蛋白质在细胞内降解。
在蛋白定位于膜上之前,还有切除信号肽和定向(N端或C端在膜外)的问题,具体细节还不清楚。
定位于膜结构上的一些蛋白质,其跨膜结构域中的疏水氨基酸不但有利于蛋白质固定在脂质膜上,还带有蛋白质投送到哪类膜结构的信号。
以定位于高尔基体的α2,6唾液酸转移酶(α2,6ST)为例,有人将此酶的胞质、跨膜和茎区三个结构域(分别为9、17、18年氨基酸残基)的编码cDNA分别和另一个定位于细胞表面膜的属于Ⅱ型膜蛋白的二肽酰肽酶Ⅳ(DPPⅣ)相应的三个结构域(分别为6、23、18个氨基酸残基)的cDNA互相杂交融合,再配上小鸡溶菌酶的基因作为报告基因。
将重组质粒在COS细胞中表达,用免疫荧光法检测报告蛋白溶菌酶的细胞定位。
结果发现:
融合酶蛋白中如带有α2,6ST的跨膜域序列都能投送到高尔基体,而带有DPPⅣ胞质跨膜域序列的融合蛋白则投送到细胞表面。
如融合酶的茎区也来自ST或在DPPⅣ胞质域C端加上两个带正电荷的Lys,也能加强融合酶投送到高尔基体而使其在细胞表面的定位减少。
如果用多聚Leu取代跨膜区的疏水序列,只有当多聚Leu中的Leu数相当于ST跨膜域的残基数(17个)以及茎区也来自ST时,融合蛋白才投送到高尔基体而当L数目相当于DPPIV跨膜域的残基数(23个)或茎区来自DPP时则融合蛋白投送到细胞表面(表3)。
由此可见,跨膜区疏水氨基酸的序列及数目对酶蛋白投送到高尔基体膜还是细胞表面膜具有决定性作用,而茎区的序列也与膜蛋白的定位有关。
线粒体能自身合成定位于内膜的少量酶蛋白,但90%以上的线粒体蛋白是在胞质核糖体上合成其前体,后者再通过复杂的过程投送到线粒体内。
一般可有3种不同的方式:
①一些存在于线粒体基质的可溶性酶蛋白,如细胞色素氧化酶亚基Ⅳ、F1-ATP酶β亚基和鸟氨酸转氨甲酰基本酶等的前体蛋白的N端都有一段前序列(presequence),约20~30个残基,其作用肽和信号肽一样,可引导酶蛋白进入线粒体。
如将这段前序列融合到其他蛋白质上能使后者也进入线粒体。
不同酶蛋白的前序列也没有同
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