山羊IGFBP6基因的克隆及其组织表达的发育性变化游杰.docx

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山羊IGFBP6基因的克隆及其组织表达的发育性变化游杰

山羊IGFBP-6基因的克隆及其组织表达的发育性变化

动物科学（特种经济动物养殖方向）2008级游杰

指导教师张红平教授

摘要：

IGFBPs在体内循环系统中能与IGFs结合，延长IGFs的半衰期，调节IGFs的代射清除率，提高IGFs的生物学效应。

肝脏和局部组织分泌的IGFBPs共同调控各个组织的生长与发育，从而促进动物机体的生长。

本研究以培育品种南江黄羊为试验材料，应用RT-PCR和克隆技术克隆山羊IGFBP-6基因的全编码区序列，采荧光定量PCR技术研究该基因在南江黄羊生后5个时间点（0d、30d、60d、90d、120d）和6个组织（肝脏、肺、心脏、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）的发育性变化。

结果表明：

克隆得到南江黄羊IGFBP-6基因的CDS全序列长度为711bp，编码235个氨基酸，该基因的核苷酸、氨基酸序列同绵羊的一致性为97%，与其他物种间的一致性也较高；在各个时间点的各个组织中都检测到IGFBP-6基因的表达，但相对表达量存在一定的差异。

IGFBP-6在背最长肌的基因表达量远远高于肝脏、心脏、脾脏、肺脏和其它肌肉等组织的表达量（0.01

关键词：

南江黄羊；IGFBP-6基因；克隆；荧光定量PCR；表达

CloningofGoatIGFBP-6GeneanditsDevelopmentalChangeinTissueExpression

YouJie,Animal science（Special economical animalbreeding）,Grade2008

SupervisedbyProfessorZHANGHongping

Abstract:

IGFBPs（insulin-likegrowthfactors,IGFs）familyplayanimportantroleinmaintainingnormalphysicalactivitiesandprocesses,includingembryodifferentiation,bodydevelopment,sugar,lipidandproteinmetabolism.IGFBPscanprolongthehalf-lifeofIGFs,enhanceitsbiologicalactivityandregulateitsmetabolismclearancebybindingIGFsincirculationsystem.IGFBPssecretedfromliverandotherlocaltissuescanregulateandstimulategrowthoftissuescorporately.Inthisstudy,Nanjiangyellowgoatwaschooseasexperimentalmaterial.RT-PCRandcloningtechnologywereemployedtoclonethefullcodingsequenceofIGFBP-6genesoutthetotalRNAsextractedfromlivertissueat0dafterbirth,followedbyusingofQ-PCRtoidentifytheprofileofgeneexpressionindifferenttissues（liver,lung,heart,longissimusdorsi,semimembranosus,musculustriceps）andatdifferenttimepoints（0d、30d、60d、90d、120dafterbirth）.Theresultsindicate:

（1）WehaveclonedtheCDSfullsequenceofIGFBP-6（711bp）,whichencodingapeptideconsistsof235aminoacidresidues.ThenucleotideandaminoacidsequenceofIGFBP-6possesshighhomogeneitywithsheep-about97%ofitssequence-aswellasotherspices;

（2）WehavedetectedtheexistenceofIGFBP-6mRNAinalltissuesandateachtimepointswechoose,buttheexpressionleveldifferfromeachother.Itexpressmorehigherinlongissimusmusclethanliver,heart,lungandothermuscletissues（0.01

KeyWords:

Nanjiangyellowgoat,IGFBP-6,Clone,Q-PCR,Expression

1文献综述

1.1IGFBPs的研究进展

1.1.1IGFs简介

胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactors,IGFs）系统在正常生理活动中起着极为重要的作用，其与胚胎分化、个体发育密切相关，而且参与糖、脂肪和蛋白质代谢。

IGF家族由2个生长因子（IGF-I和IGF-II）、IGF受体（IGF-IR和IGF-IIR）、IGF结合蛋白（IGFBPs）及IGF蛋白水解酶组成。

IGF-I和IGF-II结构与胰岛素相似，是两个同源性较高、分子量大约为7KDa的多肽类激素[1]。

Salmon和Daughaday（1957）在研究生长激素（growthhormone,GH）作用时，首次发现了血清中含有胰岛素样作用的促生长因子，命名为“硫化因子”[2]，因其具有拟胰岛素样活性[3]和刺激增殖活性[4]命名为生长调节素[5]，随后被命名为IGFs[6]。

IGFs在许多组织中均有表达，IGFs除了通过旁分泌方式发挥作用外[7]，还可以在局部以自分泌的方式促进细胞增殖[8]。

IGFs通过与细胞表面特定受体（IGF-I受体和IGF-II受体）结合发挥其生物学作用，也可以与胰岛素受体结合发挥作用。

IGFs主要通过与IGF-I受体结合发挥促进有丝分裂的作用，IGF-I受体与胰岛素受体结构相近，均具有受体酪氨酸激酶活性。

IGF-II受体与胰岛素受体无同源性，主要与IGF-II结合。

IGF-II受体对IGF的调节作用目前尚不清楚[9]。

存在于血液和细胞间隙中的IGFs绝大部分与IGF结合蛋白（IGFBPs）结合。

IGFs与IGFBPs的亲和力高于IGF-I受体，因此IGF生物活性和对IGF的代谢与IGFBPs密切相关[10]。

1.1.2IGFBPs的概况

胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactors,IGFs）系统在正常生理活动中起着极为重要的作用，其与胚胎分化、个体发育密切相关，而且参与糖、脂肪和蛋白质的代谢[11]。

IGFBPs是IGFs的重要组成之一，IGFBPs对于调节IGFs的生物学功能主要表现在以下四个方面：

（1）IGFs运载蛋白的作用，并可调节血液中游离IGFs含量；

（2）延长IGFs的半衰期，调节IGFs的代射清除率；（3）对特异性组织、细胞进行识别和定位；（4）调节IGFs的生物学效应，通过调节IGFs和IGFs受体的相互作用来完成；（5）不用依赖于IGFs而直接调节正常和恶性细胞的生长[12-15]。

目前发现IGFBPs家族有6个成员，分别命名为IGFBP1～6。

IGFBPs在氨基酸结构上高度保守，在总蛋白质中有35%左右氨基酸是同源的。

IGFBPs具有一些共同结构和特征，都能与IGFs结合，同源性较高。

它们在人体组织和器官中分布不同，虽然都能与IGFs结合，但产生的生物学作用也不尽相同[16]。

1.1.3IGFBPs的结构和功能

IGFBPs成熟蛋白均由200～300个氨基酸残基组成，其中20～40个氨基酸残基形成信号序列，并含有18个半胱氨酸残基，组成9对链内二硫键。

如果把IGFBPs平均分成三个区，即N端区、中间区、C端区，则其中12个Cys分布在N端区，另6个分布在C端区，但N端区和C端区之间无二硫键连接[16]。

上述氨基酸的排列相当保守，表明二硫键在形成高亲和力的IGFs位点中起重要的作用。

但也有例外，在人和鼠中IGFBP-6分别缺乏2个和4个氨基酸；而IGFBP-4则含有20个半胱氨酸残基。

在N端区域中，IGFBPs存在保守的GCGCCxxC模体，但IGFBP-6为GCAEAEGC结构，该结构的意义还不清楚。

另外IGFBPs的成员一些特殊结构，IGFBP3-6均有糖基化现象，除IGFBP-6的糖基化位点在C端外，IGFBP3-5均位于肽链中间区[17]。

IGFBP1-2结构中没有糖基化的现象，但在其C端区域均保留有Arg-Gly-Asp（RGD）一致序列。

IGFBP-6参与生长、发育、生殖及血糖等生理过程，是一个多功能蛋白。

在人和猪上IGFBP-6研究较多。

人IGFBP-6的研究主要集中于肿瘤的抑制。

顾以韧等[18]采用荧光定量PCR技术检测了长白猪和梅山猪的背最长肌组织中IGFBP-6基因的表达丰度，研究结果显示IGFBP-6基因在两猪种中表达模式相似，均在4月龄时表达量达到最高后出现极显著下降。

这些都证明了IGFBP-6在肌肉的生长中具有重要的作用。

而在山羊研究的比较少。

针对于其与IGF-II高亲和力的特点，可以推测其可能的生物学作用。

近几年研究也表明，IGF-II在胎儿生长发育，肿瘤细胞增殖和肌肉生长等方面具有重要调控作用，是影响山羊产肉量的主要候选基因。

IGF-II在生长发育中具有重要作用，IGFBP-6可能通过与IGF-II结合而间接影响生长。

2本研究的目的和意义

本研究采用基因克隆、实时荧光定量等现代分子生物学技术，以我国培育的第一个肉用山羊品种——南江黄羊为研究对象,克隆南江黄羊IGFBP-6基因CDS区序列，研究IGFBP-6基因在南江黄羊出生后的不同时期以及同一时期不同组织的表达变化规律，以揭示山羊早期生长发育的基因调控与表达规律，为我国肉用山羊的分子标记辅助选择、品种分子设计以及快速培育肉用山羊新品种（系）提供科学依据。

3材料与方法

3.1试验材料

3.1.1试验动物

试验动物来自巴中市南江县南江黄羊育种场，生后0d选取2头公羊和2头母羊，生后30d、生后60d、生后90d和生后120d等4个时间点各选取了3头公羊和3头母羊，共28头羊（见表1）。

随机选取符合时间段的羊宰杀，取其心脏、肝脏、肺脏、背最长肌、半膜肌、臂三头肌共6个组织。

采样后快速置于液氮中带回试验室，放置于-80℃冰箱中保存备用。

表1采样信息表

Table1Informationofsample

日龄Day

0d

30d

60d

90d

120d

雄性Male

2

3

3

3

3

雌性Female

2

3

3

3

3

3.1.2仪器与试剂

3.1.2.1主要仪器

微量可调移液器；梯度PCR仪；紫外透射仪TMW-20；核酸蛋白检测仪SmartSpecTMPlus；电子天平；水平电泳仪；常温冰箱；低温冰箱-20℃；超低温冰箱-80℃，；超净工作台；RT-PCR仪。

3.1.2.2主要试剂盒与试剂

Trizol总RNA抽提试剂盒，氯仿、无水乙醇，反转录试剂盒，2×TaqPCRMasterMix，DNA胶回收试剂盒，克隆载体试剂盒，实时荧光定量PCR试剂盒

3.2试验方法

3.2.1总RNA的提取

按照上海生工Trizol总RNA抽提试剂盒（UNIQ-10柱式）说明书提取组织总RNA。

3.2.2总RNA质量检测

l%的琼脂糖凝胶电泳，检测RNA质量，对符合要求的总RNA样品，用核酸蛋白检测仪在260nm和280nm下测定吸光度，按A260/A280接近2.0（可接受范围为1.9-2.1）评估总RNA样品纯度。

3.2.3引物设计

检索NCBIGenBank数据库中公布绵羊（Ovisaries）的IGFBP6基因的基因登录号，分别为NM_001134308，并下载其序列。

采用Prime5.0软件对这个基因序列设计引物，包括完整的开放阅读框，并用Oligo6.0进行评价，设计的引物采用NCBI网站BLAST工具进行比对检索，验证引物的特异性，引物信息如表2。

引物由大连宝生物公司合成。

表2IGFBP-6基因的引物信息表

Table2PrimerpairsdesignedforIGFBP-6genes

基因

Gene

引物序列

Sequenceofprimer

扩增温度

Tm

片段大小

Length

IGFBP-6

F：

5-AGCTTTGCTGCGACTGCTCT-3

59℃

801bp

R：

5-ATGCTCCTGCCAGTGGCCTT-3

3.2.4cDNA第一条链合成

（1）RNA变性：

将模板RNA65℃水浴5分钟，立即置于冰上冷却（对容易形成高级结构的RNA可提高逆转录效率）。

（2）按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5秒钟，简短离心，并置于冰上，如果要做多个逆转录反应，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上。

（3）逆转录反应，先37℃，15分钟；然后98℃，5分钟（酶失活），反应结束后，将所得的cDNA于-20℃保存。

表3RT反应体系

Table3RTReactionsystem

试剂名称

体积

5×RTbuffer

8µl

RTEazymemix

2µl

Primermix

2µl

RNAaseInhibitor

2µl

RNase-freeH2O

18µl

模板总RNA

4µl

总体积

40µl

3.2.4荧光定量PCR引物设计

根据已克隆得到的IGFBP-6的CDS区序列，选择β-actin作为内参基因，利用Primer5软件设计引物，引物由上海生物工程生物技术服务有限公司合成。

3.2.5引物特异性检测

取所有组织经反转录得到的cDNA各1µl，加入到相应的反应体系中，设定退火温度梯度为55℃-65℃，分别对每个基因的熔解曲线进行分析，检测引物的特异性。

同时根据熔解曲线确定每个基因的最佳退火温度（Ct值最小）。

将产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异目的片段。

3.2.6标准品的制备

分别取每个基因（Ct值最小的管）扩增产物溶液10µl，加入90µl去离子水进行稀释，作为原始管。

然后从原始管中取稀释液50µl，加入450µl去离子水进行稀释后作为第一管。

接着从第一管中取稀释液50µl，加入450µl去离子水进行稀释后作为第二管。

如此反复，进行10倍浓度梯度稀释。

各梯度稀释液作为标准品备用。

3.2.7标准曲线的绘制

取10-1～10-10的标准品各1µl加入到相应的反应体系中，在同样的反应条件下（除退火温度不同外）进行扩增。

根据荧光定量PCR仪绘制的PCR动力学曲线，以样品的拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，分别绘制IGFBP-6和β-actin基因的标准曲线。

3.2.8实时荧光定量PCR

将模板cDNA解冻，取1µl样品建立12.5µl反应体系。

反应体系如表3。

体系配好后彻底混匀，上机，最后通过标准曲线来计算未知样品的起始拷贝数。

反应体系在伯乐iq5荧光定量PCR仪上进行。

检测中为每个待测样品cDNA设置3个重复，对得到的3个Ct值取平均值，以备带入公式进行计算。

反应条件如下：

95℃预变性30s。

然后95℃变性5s，63.5℃退火30s，72℃延伸15s，共40个循环。

熔解曲线分析：

95℃1min，55℃1min。

然后从55℃开始，每个循环温度增加0.5℃，时间为10s，81个循环，整个过程收集荧光。

根据样品荧光曲线和内参荧光曲线的Ct值计算定量结果。

表4PCR反应体系

Table4PCRReactionsystem

组成成分

12.5µl体系

2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution

5.65μl

正向引物（10uM）

0.2µl

反向引物（10uM）

0.2µl

cDNA模板

1µl

RNase-freeH2O

5.45µl

2.2.9统计分析

采用相对定量解析方法，选用β-actin作为看家基因，对扩增效率达到要求的样品，根据定量仪器自带分析软件计算各基因各时间点的拷贝数，以目的基因mRNA的拷贝数（单个部位的不同时间点/单个时间点不同部位的样品的最大拷贝数设为1）与对应样品内参基因mRNA的拷贝数（单个组织的不同时间点/单个时间点不同组织最大拷贝数设为1）的比值表示基因mRNA的相对表达量。

运用SAS8.0软件的PROCGLM程序进行最小二乘分析，结果以最小二乘均数±标准差表示，用Duncan法进行均数间的多重比较。

3试验结果与分析

3.2荧光定量分析

3.2.1Real-timePCR标准曲线的建立

根据回收的标准品DNA，按照1×10-3~1×10-9的范围梯度内进行IGFBP-6基因及看家基因的定量反应。

得到2条Real-timePCR标准曲线。

β-actin基因标准曲线的扩增效率在98.3%~98.6%之间，相关系数在0.997~1.000之间，得到的标准的扩增效率及拟合度较好，选择的5个或6个点均匀分布在标准曲线上，可以用于表达量定量的分析。

3.2.2荧光定量PCR扩增产物的特异性

在荧光定量PCR扩增程序中，设定扩增产物的溶解曲线。

荧光定量PCR反应完成后，将反应产物温度降低到55℃，然后每10sec升高0.5℃，同时实时检测SYBRGreen的荧光信号强度。

随着温度升高，DNA双链打开，荧光信号逐渐降低。

当DNA解链时，荧光信号强度降急剧降，此时的温度为融解温度（Tm）。

对于某一特定的产物，其DNA链的长度和C+G含量决定其Tm，因此其Tm值固定。

通过对扩增产物Tm值分析，可以衡量扩增的特异性（如图3）。

A

B

图3IGFBP-6和β-actin基因的扩增产物熔解曲线

Fig.3MeltcurveofIGFBP-6andβ-actingeneamplificationproduct

结果表明：

各个基因扩增产物的溶解曲线均为单峰曲线。

表明各个基因的荧光定量PCR扩增过程中，没有非特异性产物和引物二聚体形成，扩增过程的荧光信号均为特异扩增产物的荧光信号。

3.5IGFBP-6基因的表达差异

3.5.1IGFBP-6基因的性别表达差异

IGFBP-6基因的性别表达在不同时间段器官中存在差异，如表4、5和图5。

IGFBP-6基因在在出生0d的背最长肌组织中mRNA的表达量、在出生90d的半膜肌中、出生后120d的肝脏和心脏组织中在公母羊之间存在极显著差异（P<0.01），在出生后90d的肝脏和心脏组织中mRNA的表达量在公母羔羊之间存在显著差异（P＜0.05）。

在肝脏、心脏、肺脏、肌肉组织中，其他各时间点IGFBP-6基因表达量在性别之间差异不显著（P＞0.05）。

3.5.2IGFBP-6基因的组织表达差异

根据出生后各阶段不同组织IGFBP-6基因表达量的差异，如图4，基本呈现背最长肌表达量最高，IGFBP-6基因表达量总是极显著高于其他组织（P＜0.01），其次为肺脏和心脏组织，其它组织的表达量最低。

另外，肺脏组织在出生后30d的IGFBP-6基因表达量是极显著高于除背最长肌外其他组织（P＜0.01），心脏组织在出生后0d、90d和120d的IGFBP-6基因表达量是极显著高于除背最长肌外其他组织（P＜0.01），在出生后120d，肺脏中IGFBP-6基因表达量显著高于除背最长肌外其他组织（P＜0.05）。

图4IGFBP-6基因的组织表达差异

Fig.4ThedifferenceofrelativeexpressionofIGFBP-6geneinsixtissues

表4IGFBP-6基因的表达差异

Table.4ThedifferenceofrelativeexpressionofIGFBP-6geneinsixtissues

注：

A：

肝脏；B：

肺脏；C：

心脏；D：

背最长肌；E：

半膜肌；F：

臂三头肌；。

Note：

A：

liver；B：

lung；C：

heart；D：

longissimusdorsi；E：

semimembranosus；F：

musculustriceps；

A肝脏

日龄

Day

表达量均值

ExpressionofMean

公母均值

MaleandFemaleofMean

标准误

StandardErrorofMean

0d

3.43

3.431008

♀

0.1016234

4.058198

♂

0.6741478

30d

1.48

1.324202

♀

0.0952961

1.626330

♂

0.1656889

60d

4.01

4.190883

♀

1.1058639

3.888530

♂

0.8204965

90d

4.81

5.938675

♀

1.0062951

3.686791

♂

0.649097

120

4.84

2.874492

♀

0.1308505

6.153629

♂

0.5129864

B肺脏

日龄

Day

表达量均值

ExpressionofMean

公母均值

MaleandFemaleofMean

标准误

StandardErrorofMean

0d

8.16

6.6434298

♀

1.0511032

9.6782505

♂

1.7119885

30d

89.00

105.58382

♀

5.038187

77.938686

♂

17.10513

60d

3.98

2.7861950

♀

0.3448605

5.1792047

♂

1.3484036

90d

2.49

5.4391774

♀

0.3237497

1.5083195

♂

0.1185209

120

5.75

6.6006072

♀

0.4797774

4.8944026

♂

0.2706046

C心脏

日龄

Day

表达量均值

ExpressionofMean

公母均值

MaleandFemaleofMean

标准误

StandardErrorofMean

0d

3.58